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干貨 | 雙熒光素酶驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控作用
轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要調(diào)節(jié)因子。不同轉(zhuǎn)錄因子的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別不同基因啟動(dòng)子區(qū)特定的堿基序列，行使抑制或激活該基因轉(zhuǎn)錄的功能。將目的基因啟動(dòng)子區(qū)域（通常取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS 上游-2000bp）、或針對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變、或分段截?cái)嘈蛄校瑯?gòu)建到報(bào)告基因載體luciferase 的上游，共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)熒光素酶活反映轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子活性的調(diào)控作用。
圖1.轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子調(diào)控示意圖
常用載體：pGL3-Basic 、pGL3-Promoter
圖2 .載體信息
翌圣雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)服務(wù)流程
客戶(hù)提供 | 翌圣服務(wù) | 客戶(hù)所得 |
1、待研究啟動(dòng)子基因詳細(xì)信息 2、轉(zhuǎn)錄因子詳細(xì)信息 | 1、轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 2、方案設(shè)計(jì)、引物設(shè)計(jì)與合成 3、序列合成、質(zhì)粒構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 4、熒光素酶活性檢測(cè) | 1、項(xiàng)目所得質(zhì)粒及菌液 2、中間樣品 3、完整項(xiàng)目報(bào)告 |
實(shí)驗(yàn)步驟
目的細(xì)胞質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)預(yù)實(shí)驗(yàn)
當(dāng)選擇在目的細(xì)胞（而非293 工具細(xì)胞）中進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先要確認(rèn)目的細(xì)胞的質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率，以及摸索合適的瞬轉(zhuǎn)體系，質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率>40%以上時(shí)表明預(yù)實(shí)驗(yàn)通過(guò)。
目的細(xì)胞質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)預(yù)實(shí)驗(yàn)
a. 將狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的空白細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用wanquan培養(yǎng)基懸浮成
單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種于24 孔培養(yǎng)板中；
b. 培養(yǎng)過(guò)夜，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。在細(xì)胞覆蓋率70%左右時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；
c. 轉(zhuǎn)染2 h 前換液為新鮮的培養(yǎng)基；
d. 轉(zhuǎn)染取無(wú)菌的1.5 mL EP 管，按照轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染復(fù)合物配置
e. 轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞樣品。
報(bào)告基因檢測(cè)
細(xì)胞樣品收集
a. 轉(zhuǎn)染后從培養(yǎng)箱中取靶細(xì)胞，輕輕吸凈培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次；
b. 棄去PBS，每孔加入100μL 的1×PLB（5X Passive Lysis Buffer 用無(wú)菌水稀釋而得）；
c. 細(xì)胞裂解后，將樣品轉(zhuǎn)移入Ep 管中，-80 度冰箱保存。
根據(jù)報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行檢測(cè)
a. 將充分裂解后的裂解產(chǎn)物，10,000-15,000 rpm 離心3-5 min。離心后將上清液移入新的EP 管進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。
b. Renilla Luciferase Assay 工作液的配置：按照樣品要求的量，將Renilla Luciferase Assay Reagent(100×)按照稀釋比例加入Renilla Luciferase Assay buffer，混勻后室溫放置。
c. 熒光素酶檢測(cè)：
按照儀器說(shuō)明書(shū)要求將熒光檢測(cè)打開(kāi)，設(shè)定參數(shù)，測(cè)定時(shí)間為10 s，測(cè)定間隔為2 s；將樣品按照20 μL 的體積加入測(cè)量管中（保持每次樣品的加樣量一致），另外加入20 μL Firefly Luciferase Assay Reagent 混勻2-3 次（不能漩渦混勻），充分混勻后測(cè)定RLU（Relative light unit），同時(shí)設(shè)置Cell Lysis buffer 為空白對(duì)照孔；將檢測(cè)后的樣品，加入20 μL 配制的Renilla Luciferase Assay 工作液混勻2-3 次，充分混勻后測(cè)定RLU，同時(shí)設(shè)置Renilla Luciferase Assay 工作液為空白對(duì)照孔。
數(shù)據(jù)處理與分析，計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度
提供原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與完整實(shí)驗(yàn)報(bào)告
常規(guī)檢測(cè)分組
（1）過(guò)表達(dá)對(duì)照+啟動(dòng)子對(duì)照+海腎內(nèi)參(TK)
（2）過(guò)表達(dá)對(duì)照+啟動(dòng)子野生型+海腎內(nèi)參(TK)
（3）過(guò)表達(dá)對(duì)照+啟動(dòng)子突變型+海腎內(nèi)參(TK)
（4）轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)+啟動(dòng)子對(duì)照+海腎內(nèi)參(TK)
（5）轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)+啟動(dòng)子野生型+海腎內(nèi)參(TK)
（6）轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)+啟動(dòng)子突變型+海腎內(nèi)參(TK)
實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果
轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)靶基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性
轉(zhuǎn)錄因子抑制靶基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性
翌圣可提供雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)服務(wù)，加快基礎(chǔ)研究及藥物篩選進(jìn)度
服務(wù)類(lèi)型 | 客戶(hù)提供 | 服務(wù)內(nèi)容 | 周期 |
雙熒光素酶驗(yàn)證miRNA 與靶基因3’UTR 相互作用 | 1、miRNA基因及物種（具體的ID信息） 2、靶基因基因及物種 3. 結(jié)合位點(diǎn)信息 | 1、miRNA與3’UTR結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 2、方案設(shè)計(jì)、引物設(shè)計(jì)合成 3、miRNA mimics合成、質(zhì)粒構(gòu)建 4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因檢測(cè)
| 25-30個(gè)工作日 |
雙熒光素酶驗(yàn)證lncRNA 與miRNA 相互作用 | 1、lcnRNA基因及物種 2、miRNA基因及物種（具體的ID信息） 3、結(jié)合位點(diǎn)信息 | 1、lncRNA 與miRNA結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 2、方案設(shè)計(jì)、引物設(shè)計(jì)合成 3、miRNA mimics合成、質(zhì)粒構(gòu)建 4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因檢測(cè) | 25-30個(gè)工作日 |
雙熒光素酶驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控作用 | 1、啟動(dòng)子信息（名稱(chēng)、物種、序列） 2、啟動(dòng)子基因模板（或委托我司合成/克?。?/span> 3、 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞（若選用293T細(xì)胞無(wú)需提供） | 1、轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 2、方案設(shè)計(jì)、引物設(shè)計(jì)合成 3、序列合成、質(zhì)粒構(gòu)建 4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因檢測(cè) | 30-35個(gè)工作日 |
信號(hào)通路分析 | 通路下游的響應(yīng)元件序列 | 1、方案設(shè)計(jì)、引物設(shè)計(jì)合成 2、序列合成、質(zhì)粒構(gòu)建 | 30-35個(gè)工作日 |
SNP 活性分析 | 基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在單核苷酸多態(tài)性（SNP)信息 | 1、方案設(shè)計(jì)、引物設(shè)計(jì)合成 2、序列合成、質(zhì)粒構(gòu)建 | 30-35個(gè)工作日 |
相關(guān)產(chǎn)品清單
產(chǎn)品類(lèi)別 | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品規(guī)格 |
雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑 | Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒 | 11402ES60/80 | 100T/1000T |
Dual Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit 輝光型雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒 | 11405ES60/80 | 100T/1000T | |
轉(zhuǎn)染試劑 | Hieff Trans® Liposomal Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑 | 40802ES01/03 | 100μL/1mL |
Hieff Trans® in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑 | 40806ES01/02/03 | 0.1mL/0.5mL /1mL | |
Hieff Trans® mRNA Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑 | 40809ES01/03 | 0.1mL/1mL |
相關(guān)產(chǎn)品
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