Mustard seed major allergen Sin a1 activates intestinal epithelial cells and also dendritic cells that drive type 2 immune responses

KWS：Mustard seed；Sin a1；intestinal epithelial cells；immune responses；dendritic cells

在過(guò)去的幾十年里，食物過(guò)敏的患病率急劇增加，這是一個(gè)重大的健康問(wèn)題。腸道上皮屏障穩(wěn)態(tài)受到其與微生物群和粘膜免疫系統(tǒng)以及來(lái)自外部食物成分的相互作用的高度調(diào)節(jié)。這種體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞會(huì)導(dǎo)致食物過(guò)敏。主要食物過(guò)敏原的內(nèi)在特性可能有助于激活上皮細(xì)胞并驅(qū)動(dòng) 2 型樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）活化的發(fā)展，這是導(dǎo)致過(guò)敏免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第一步。

許多經(jīng)常食用的食物，如披薩和番茄醬，都含有芥菜籽作為增味劑。在臨床水平上，大多數(shù)對(duì)芥菜籽過(guò)敏的患者對(duì) Sin a1 敏感，該蛋白屬于過(guò)敏原中的一個(gè)大家族—2S 白蛋白家族，花生、堅(jiān)果、豆類、芝麻都有相似的蛋白。先前的研究報(bào)道了不同的 2S 白蛋白能夠穿過(guò)腸道細(xì)胞單層，而不影響通透性，同時(shí)激活這些上皮細(xì)胞以產(chǎn)生免疫介質(zhì)。然而，目前尚不清楚這是否會(huì)引起 Sin a1 的上皮激活，從而導(dǎo)致食物過(guò)敏。

因此，在荷蘭烏得勒支大學(xué)理學(xué)院藥理學(xué)系、西班牙康普頓斯大學(xué)生物化學(xué)和分子生物學(xué)系團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，使用人腸道上皮細(xì)胞（IECs）分析了 Sin a1 通過(guò)腸粘膜的致敏能力，同時(shí)利用共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)一步確定 Sin a1 暴露是否可以驅(qū)動(dòng)先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞中的 2 型表型。研究成果發(fā)表在 Food & Function 期刊題為“Mustard seed major allergen Sin a1 activates intestinal epithelial cells and also dendritic cells that drive type 2 immune responses”。

食物過(guò)敏原與腸上皮屏障的相互作用被認(rèn)為是口腔致敏的第一步。首先，在人結(jié)腸癌細(xì)胞系 HT-29 和/或Caco-2中研究了暴露于純化 Sin a1 后的上皮細(xì)胞的活化和屏障完整性（圖1 A）。為了確定上皮活化，測(cè)量了細(xì)胞因子（IL-33和TSLP）和趨化因子（CCL20和CCL22）的存在，這些因子參與DC和/或啟動(dòng)DC來(lái)刺激Th2細(xì)胞發(fā)育，驅(qū)動(dòng)2型免疫反應(yīng)。此外，IL-8 也作為一般炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物。

HT-29 細(xì)胞暴露于濃度遞增的 Sin a1（圖1 B），發(fā)現(xiàn)Sin a1 以劑量依賴性方式增加 CCL20 和 IL-33 濃度，而 CCL22 和 IL-8 不受影響，未檢測(cè)到 TSLP（圖1 C）。此外，Sin a1 不影響細(xì)胞活力，YMSE 和 LPS 都不像 Sin a1 一樣誘導(dǎo)上皮活化成 2 型。62.5 μg ml?1 的YMSE 誘導(dǎo)了 HT-29 細(xì)胞分泌 IL-8。

Caco-2 細(xì)胞暴露于不同濃度的 Sin a1，發(fā)現(xiàn)過(guò)敏原的存在不會(huì)影響細(xì)胞活力。最高劑量的 Sin a1 增強(qiáng)了 IEC 釋放的 CCL20，而 5 μg mL 的Sin a1使 IL-33 水平增加。CCL22 未觀察到顯著變化，TSLP 和 IL-8 均未檢測(cè)到。

這些結(jié)果表明，Sin a1 能夠相互作用并激活上皮細(xì)胞以啟動(dòng)促過(guò)敏性免疫反應(yīng)。由于在 HT-29 中，Sin a1 劑量依賴性地增加了 IL-33 和 CCL20，因此選擇這些細(xì)胞使用 25 μg mL-1 的劑量進(jìn)一步研究 Sin a1 激活上皮細(xì)胞對(duì) DC 成熟和下游 2 型極化的影響。

圖1    Sin a1 與 IEC 的相互作用。

通過(guò)胃腸道致敏的下一步是募集抗原呈遞細(xì)胞，如 DCs。上皮介質(zhì)可能會(huì)將 DC 功能修飾為 2 型驅(qū)動(dòng)表型，一旦過(guò)敏原被捕獲，它們就會(huì)遷移到淋巴結(jié)并將其呈遞給初始 T 細(xì)胞，從而驅(qū)動(dòng)2 型免疫反應(yīng)的極化。為了模擬這個(gè)過(guò)程，研究建立了一個(gè)共培養(yǎng)模型。HT-29 與 DC（IEC-DC）共培養(yǎng)或DC 單獨(dú)培養(yǎng)，這兩種情況均暴露于單劑量的 Sin a1 （圖2 A）。48 小時(shí)后，對(duì)來(lái)自基底外側(cè)腔室的靶細(xì)胞因子的分析顯示，在頂部腔室存在或不存在 HT-29 的情況下，免疫激活同時(shí)具有 2 型和 1 型表型（圖2 B）。Sin a1 增加 IL-25、CCL20 和 IL-15 水平。無(wú)論 Sin a1 是否存在，IEC 降低了 CD86 在 DC 中的表達(dá)，而 CD80 的表達(dá)趨于增加（圖2 C）。在存在或不存在 IEC 的情況下，與培養(yǎng)基對(duì)照相比，Sin a1 不影響 DC 的 OX40L、CD86 和 CD80 表達(dá)。與培養(yǎng)基對(duì)照相比，使用 LPS（DC1）或細(xì)胞因子混合物（DC2）的成熟對(duì)照組顯示OX40L 和 CD80 增加，CCL20 和/或 CCL22 分泌增加。

圖2    暴露于 Sin a1 的 DCs 及其與 HT-29（IEC-DC）的共培養(yǎng)。

接下來(lái)，致敏階段進(jìn)入 DC 與 T 細(xì)胞的相互作用。因此，將同種異體原始 T 細(xì)胞與DC 共培養(yǎng)（圖3 A），并測(cè)定細(xì)胞因子譜和 T 細(xì)胞表型。細(xì)胞因子分析顯示，當(dāng) IEC-DC 或 DC 在前一步暴露于 Sin a1 時(shí)，IEC-DC/T 細(xì)胞和 DC/T 細(xì)胞中 IL-4 表達(dá)顯著增加（圖3 B）。IL-10 遵循類似的趨勢(shì)。流式細(xì)胞術(shù)顯示，當(dāng) IEC 暴露于 Sin a1 時(shí)，來(lái)自 IEC-DC/T 細(xì)胞的 T 細(xì)胞中 IL-13 表達(dá)顯著增加。此外，直接暴露于 Sin a1 的 DCs 傾向于增加 T 細(xì)胞上 CRTH2（Th2 標(biāo)志物）的表達(dá)，而 CXCR3（Th1 標(biāo)志物）的表達(dá)降低 （圖3 C）。此外，在這種情況下，MFI CRTH2/MFI CXCR3 的比率顯著增加，在 DC2/T 細(xì)胞對(duì)照中也是如此，表明平衡向 Th2 型轉(zhuǎn)移（圖3 C）。

這些數(shù)據(jù)表明，在 2 型免疫環(huán)境中，Sin a1 激活上皮細(xì)胞引發(fā) DC 及其與 T 細(xì)胞的相互作用。

圖3    Sin a1 誘導(dǎo)的 IEC-DC 或 DC 與初始 T 細(xì)胞共培養(yǎng)可產(chǎn)生 2 型免疫反應(yīng)。

為了研究 Sin a1 是否也引發(fā)體液免疫反應(yīng)，將上一步中的 T 細(xì)胞與來(lái)自自體供體的 B 細(xì)胞共培養(yǎng)，測(cè)定 IgE 和 IgG 水平，以及 B 細(xì)胞表型（圖4 A）。共培養(yǎng)后，在 Sin a1-IEC-DC-T/B 細(xì)胞或 Sin a1-DC-T/B 細(xì)胞上清液中未觀察到 IgE 水平的顯著變化（圖4 B）。然而，當(dāng) IEC-DC 或 DC 暴露于 Sin a1 時(shí)，第 4 天和第 18 天的 B 細(xì)胞上清液中 IgG 水平顯著增加（圖4 B）。此外，雖然在第 4 天和第 18 天可以在 T/B 細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中測(cè)量 IL-13，但僅在共培養(yǎng) 18 天后在上清液中檢測(cè)到 IL-4，并且在 Sin a1 條件下兩種細(xì)胞因子的水平不受影響。不同組間的 B 細(xì)胞表型（CD25、CD27 和 CD38 表達(dá)）不受影響（圖4 C）。當(dāng) B 細(xì)胞與 DC2 觸發(fā)的 T 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，不會(huì)影響 IgE 或 IgG 的分泌，也不會(huì)影響 B 細(xì)胞的成熟（圖4 A-C）。暴露于抗-IgM 或 IgE 混合物（抗-IgM + 抗-CD40 + IL-4）的對(duì)照 B 細(xì)胞傾向于增加IgE 釋放，并顯示 CD25 或 CD27 表達(dá)增強(qiáng)。

最后，將從 IEC-DC-T/B 細(xì)胞和 DC-T/B 細(xì)胞共培養(yǎng)物中獲得的上清液暴露于原代人干細(xì)胞衍生的肥大細(xì)胞（MCs）過(guò)夜，以確定上一步中 B 細(xì)胞產(chǎn)生的抗體介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞活化。結(jié)果顯示，Sin a1 暴露于 IEC/DC 或 DC 以驅(qū)動(dòng)免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致 MC 激活，如 2 型細(xì)胞因子分泌所示。這些結(jié)果表明，暴露于 IEC-DC-T/B 或 DC-T/B 的 T/B 細(xì)胞上清液 Sin a1 在抗-IgE 刺激下誘發(fā)肥大細(xì)胞活化。

圖4     Sin a1 暴露的 IEC-DC 或 DC 引發(fā)的 T 細(xì)胞與初始 B 細(xì)胞的共培養(yǎng)。

總之，芥菜籽過(guò)敏原 Sin a1 被證明可增強(qiáng) IECs 和 DCs 的 2 型激活，導(dǎo)致 T 細(xì)胞的 2 型免疫反應(yīng)和 B 細(xì)胞的體液免疫反應(yīng)，促進(jìn) MC 激活，導(dǎo)致 IL-4 和 IL-13 釋放。該研究可能有助于更好地了解致敏過(guò)程，同時(shí)能夠探索食物過(guò)敏預(yù)防和治療的方法。

參考文獻(xiàn)：Bueno-Díaz C, Zuurveld M, Ayechu-Muruzabal V, Korsten SGPJ, Martín-Pedraza L, Parrón-Ballesteros J, Redegeld F, Garssen J, Villalba M, Willemsen LEM. Mustard seed major allergen Sin a1 activates intestinal epithelial cells and also dendritic cells that drive type 2 immune responses. Food Funct. 2024 Jun 17;15(12):6488-6501. doi: 10.1039/d4fo01980f. PMID: 38804660.

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