一、實驗原理

細(xì)胞凍存隨著溫度降低，細(xì)胞內(nèi)的酶活性會逐漸降低，到-80℃左右，酶活性幾乎為0，代謝活動停止，可以實現(xiàn)長期保存。然而，隨著溫度降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分也會“結(jié)冰”并形成冰晶，冰晶能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。因此常加入冷凍保護(hù)劑甘油或二甲基亞砜（DMSO）。DMSO能快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，降低冰點，延緩凍存過程，同時增加細(xì)胞膜的通透性，提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。

二、實驗前準(zhǔn)備

1.細(xì)胞：選擇處于對數(shù)生長期（一般密度為80%-95%，不要使細(xì)胞長得過密）、狀態(tài)良好且無污染的細(xì)胞進(jìn)行凍存。在凍存前一天，更換新鮮的全培養(yǎng)基，確保細(xì)胞處于最佳生長狀態(tài)。

2.培養(yǎng)基：準(zhǔn)備適量的細(xì)胞培養(yǎng)所用的全培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞類型確定其配方，如 RPMI-1640、DMEM 等，并添加10%的胎牛血清（FBS），根據(jù)細(xì)胞不同，血清濃度可能會有變化，具體以培養(yǎng)細(xì)胞時需要的血清濃度為準(zhǔn)。

3.凍存液：

（1）一般使用含有 90% 全培養(yǎng)基 和 10% 二甲基亞砜（DMSO）的凍存液。DMSO 需提前預(yù)冷至 4℃以下，且要確保其質(zhì)量和純度，避免對細(xì)胞造成損傷。將凍存液在冰上或 4℃冰箱中配制，輕輕混勻。

（2）使用商品化的細(xì)胞凍存液，凍存液使用前保存在4℃冰箱。

4.凍存管：選用無菌、無 DNase 和 RNase、耐低溫的凍存管。在凍存管上清晰標(biāo)記細(xì)胞名稱、凍存日期、細(xì)胞代數(shù)等重要信息，以便后續(xù)識別和使用。

5.水平離心機(jī)：確保離心機(jī)的轉(zhuǎn)速和離心力準(zhǔn)確可靠，能夠達(dá)到 1000 - 1500 rpm 的轉(zhuǎn)速，用于細(xì)胞沉淀收集。提前清潔和消毒離心機(jī)轉(zhuǎn)頭及離心管套筒，防止交叉污染。

6.其他耗材：準(zhǔn)備無菌的移液槍及配套槍頭，不同量程的移液槍應(yīng)經(jīng)過校準(zhǔn)且在有效期內(nèi)。槍頭需為無菌、無熱原的一次性耗材，避免對細(xì)胞產(chǎn)生污染。同時，準(zhǔn)備適量的 PBS 緩沖液用于細(xì)胞洗滌，PBS 緩沖液需提前預(yù)熱至 37℃。

三、操作步驟

1. 細(xì)胞收集：

1）.以T25瓶為例，在超凈工作臺中，先將培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基輕輕吸出，用預(yù)熱至 37℃的 PBS 緩沖液緩慢沖洗細(xì)胞 2 - 3 次，每次沖洗時 PBS 緩沖液的用量以能覆蓋細(xì)胞單層為宜，一般為 5 - 10 ml。沖洗的目的是去除殘留的培養(yǎng)基和血清，減少其對后續(xù)凍存過程的影響。

2）.然后加入適量的胰酶-EDTA 溶液（根據(jù)細(xì)胞類型和培養(yǎng)瓶大小確定用量，一般 T25培養(yǎng)瓶加入1 ml）

3）.將培養(yǎng)瓶置于 37℃培養(yǎng)箱中消化 1 - 5 分鐘。在消化過程中，需密切觀察細(xì)胞形態(tài)變化。當(dāng)細(xì)胞開始變圓、收縮并逐漸從培養(yǎng)容器底部脫離時，用手輕輕拍打培養(yǎng)容器的側(cè)壁，幫助細(xì)胞全脫落。不同細(xì)胞類型的消化時間會有所不同，例如，一些上皮細(xì)胞可能需要3-5分鐘左右，而一些成纖維細(xì)胞可能需要2-4分鐘左右。

4）.用移液槍輕輕吹打細(xì)胞懸液，使細(xì)胞充分脫離培養(yǎng)瓶底部并分散均勻，避免產(chǎn)生過多氣泡。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中。

2. 細(xì)胞計數(shù)與離心：

1).取少量細(xì)胞懸液，使用血細(xì)胞計數(shù)板或細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，計算細(xì)胞濃度和活率。

2).根據(jù)細(xì)胞濃度、活率和所需凍存的細(xì)胞數(shù)量，調(diào)整細(xì)胞懸液體積；一般凍細(xì)胞的密度為1×10^6 - 5×10^6個/ml。

3).將離心管放入離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為1000 rpm，離心5分鐘。

4).離心結(jié)束后，小心取出離心管，將其置于超凈工作臺中，緩慢吸出上清液，盡量避免吸到細(xì)胞沉淀。

3. 凍存液重懸細(xì)胞：

1).根據(jù)細(xì)胞沉淀的量，加入適量預(yù)冷的凍存液，一般按照1×10^6 - 5×10^6個/ml細(xì)胞密度進(jìn)行重懸。

2).用移液槍輕輕吹打細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞均勻分散在凍存液中，確保細(xì)胞密度適中，避免細(xì)胞團(tuán)聚。

3).重懸后的細(xì)胞，盡量減少細(xì)胞存放于室溫的時間，盡快進(jìn)入凍存階段。

4. 細(xì)胞分裝與凍存：

1).將重懸后的細(xì)胞懸液分裝至標(biāo)記好的凍存管中，每管分裝的細(xì)胞懸液體積一般為 1 - 1.5 ml。在分裝過程中，要注意避免產(chǎn)生氣泡，同時確保凍存管密封良好。

2).由于使用的凍存方式不同會有不同的凍存方法，請選擇合適的凍存步驟。

a. 使用傳統(tǒng)方法：將凍存管先放入 4℃冰箱中靜置60 分鐘，使細(xì)胞逐漸適應(yīng)低溫環(huán)境。然后將凍存管轉(zhuǎn)移至 -20℃冰箱中放置2小時，接著再放入-80℃冰箱過夜。最后，將凍存管迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐中進(jìn)行長期保存。在轉(zhuǎn)移過程中，要盡量縮短凍存管在室溫及 -20℃以上環(huán)境中的停留時間，防止細(xì)胞受損。

b. 使用凍存盒：將凍存管放入4℃預(yù)冷的凍存盒（確保凍存盒已加滿或更新異丙醇）中，然后快速將凍存管轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱過夜。最后，將凍存管迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐中進(jìn)行長期保存。在轉(zhuǎn)移過程中，要盡量縮短凍存管在室溫及 -20℃以上環(huán)境中的停留時間，防止細(xì)胞受損。

c. 使用細(xì)胞凍存液：將凍存管轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱過夜，然后將凍存管迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐中進(jìn)行長期保存。在轉(zhuǎn)移過程中，要盡量縮短凍存管在室溫及 -20℃以上環(huán)境中的停留時間，防止細(xì)胞受損。