一代測序是克隆實驗中常見的下游實驗?,F(xiàn)代 DNA 測序技術(shù)源于 Sanger 鏈末端終止測序法,其工作原理與 Sanger 測序不同的是 4 組反應(yīng)的雙脫氧核苷酸分別用不同的熒光分子標記,每個試管的產(chǎn)物在光激發(fā)下發(fā)出不同顏色的熒光,延伸反應(yīng)和鏈終止完成后,將全部 4 組反應(yīng)物混合,在同一泳道進行凝膠電泳,通過激光束激發(fā)熒光分析不同位置堿基的熒光顏色完成測序分析。
一般情況下,測序信號文件多為 *.ab1 文件,該文件能夠得到每個堿基的測序峰型及整體質(zhì)量;*.seq 文件則為 ab1 文件導(dǎo)出得到的測序結(jié)果序列,ab1 文件中已具有堿基序列信息,因此 *.seq 文件可不作重點關(guān)注。
一代測序的每次測序反應(yīng)能夠產(chǎn)生約 600-900bp 堿基信息,測序開始的 5’ 端約 50bp 左右的測序信號不穩(wěn)定,檢測 800bp 左右之后信號開始衰減,各種波之間有重疊等情況。這部分結(jié)果信息不準確,不建議參考使用。
理想狀態(tài)的測序信號應(yīng)當是獨立單一的峰形信號,波峰與波谷清晰,峰與峰之間的距離均勻,波峰底部沒有雜峰干擾,此時得到的堿基信息可信度超高;測序信號出現(xiàn)雙峰、套峰等情況時,該處堿基信息可信度低,需要其他測序結(jié)果共同比對分析
◆ 套峰
a) 全雙峰:多引物結(jié)合位點(菌液、質(zhì)粒);非特異擴增(PCR 產(chǎn)物);
b) 前雙峰:多引物結(jié)合位點,其中一套模板測序中斷(菌液、質(zhì)粒);多引物結(jié)合位點(PCR
擴增未純化產(chǎn)物);引物二聚體或小片段干擾(PCR 產(chǎn)物純化非切膠樣品);
c) 中間雙峰:非單克隆(菌液、質(zhì)粒);堿基缺失或等位基因雙模板(PCR 擴增未純化產(chǎn)物);
d) 后雙峰:非單克?。ň骸①|(zhì)粒);堿基缺失(PCR 產(chǎn)物)。
◆ 測序信號
a) 無信號:引物結(jié)合位點不存在或被破壞;b) 信號差:引物或模板的質(zhì)量不高,或引物和模板匹配性低,或樣本濃度偏低;
c) 信號衰減:可能因測序序列的特殊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致,如 Poly 結(jié)構(gòu)、重復(fù)序列、回文結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、GC 富集、AT 富集等;若為正常峰形后逐漸衰減,可能模板反應(yīng)量不足;
d) 信號中斷:模板存在高級結(jié)構(gòu),導(dǎo)致 dNTP 和 ddNTP 在某位點無法與模板結(jié)合;
e) 測序移碼:測序開端移碼可能是引物降解,局部移碼可能樣本存在高級結(jié)構(gòu);
f) 測序底峰干擾:可能測序引物不純;可能測序樣品不純混有正、反向引物。
優(yōu)化方案:套峰
二聚體、小片段干擾:凝膠電泳,切膠純化回收;
多引物結(jié)合位點:更換引物測序或反向測通;
堿基缺失:構(gòu)建單克隆后測序;
非單克?。涸谳d體構(gòu)建克隆正確下重新挑取單克隆測序;
非特異性擴增:優(yōu)化反應(yīng)條件重新制備;
等位基因雙模板:構(gòu)建單克隆后測序。
測序信號
無信號:更換引物或重新提供樣品測序;
信號差:提供高質(zhì)量樣品測序;
信號衰減:特殊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致衰減,建議反向測序拼接;若正常峰形后逐漸衰減:提供高質(zhì)量樣品;
測序中斷:建議反向測序測通;
測序底峰干擾:重新制備模板,引物 PAGE 膠純化。
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深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實力、先進的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)??偛吭O(shè)在廣東,服務(wù)面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司,旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線,在各個領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品,安培生物致力于為廣大的科研機構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)??梢栽诘谝粫r間為用戶提供比較先進的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù)。 專業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術(shù)支持,深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴,安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產(chǎn)品推薦給國內(nèi)從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應(yīng)商,公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨,配合優(yōu)秀的銷售隊伍以及專業(yè)的技術(shù)支持,隨時為客戶提供服務(wù)
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