概覽

研究使用商業(yè)可用的離子化脂質(zhì)SM-102，基礎(chǔ)LNP配方為SM-102、DOPE、膽固醇和C14-PEG-2000，摩爾比為48:10:40:2。通過微流控混合技術(shù)制備mRNA- LNP，該技術(shù)通過將有機(jī)相（包含離子化脂質(zhì)、磷脂、膽固醇和PEG脂質(zhì)）與水相（包含mRNA）以可調(diào)速率混合，實現(xiàn)批次間的一致性。為了證明方案可以應(yīng)用于制備和評價各種mRNA LNP配方，實驗還制備了添加輔料的mRNA LNPs。并可在基礎(chǔ) mRNA 制劑的有機(jī)相中添加其他輔料，如單寧酸 (TA)（摩爾比為 47:9:40:2:2）、聚乙烯亞胺 (PEI)（摩爾比為 46:9:38:1:6）、DC-膽固醇-鹽酸鹽（DC-Chol）（摩爾比為 45:9:38:1:7）、環(huán)孢素（摩爾比為 47:9:40:1:3）或氯化鈣（CaCl2）（摩爾比為 33:6:27:1:33），整個脂質(zhì)混合溶液中有五種成分。還可將其他輔料以 1:1 wt% 的比例與 mRNA 混合加入水相中，如 HIV-TAT 1（TAT，轉(zhuǎn)錄肽的反式激活劑，0. 2 mg/mL）、八精氨酸（0.2 mg/mL）、5′-三磷酸腺苷（ATP）（2 mg/mL）和 Na2HPO4（2 mg/mL）稀釋在檸檬酸緩沖液（10 mM pH 3）中。

體內(nèi) mRNA-LNP 的評估實驗設(shè)計

實驗步驟

（A）使用 FLuc mRNA LNP 測量生物分布和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)水平

（i）制備 FLuc mRNA LNP，應(yīng)在有機(jī)相中加入 1% 摩爾比的 DiD 標(biāo)記物以制備 FLuc mRNA DiD-LNP。

（ii）通過尾靜脈向 C57BL/6 小鼠靜脈注射熒光素酶 mRNA 脂質(zhì)納米顆粒（每組至少 n = 3）。

（iii）在注射熒光素酶 mRNA 脂質(zhì)納米顆粒后 24 小時，使用 1.5 - 2.5% 的異氟烷對小鼠進(jìn)行麻醉。

（iv）在注射熒光素酶 mRNA 脂質(zhì)納米顆粒后監(jiān)測小鼠體重，以表明其毒性。比較注射前和注射后 24 小時小鼠的體重。通常，體重減輕不超過注射前體重的 10%被認(rèn)為是可接受的，表明對治療有良好的耐受性。體重減輕超過 10%表明對治療的耐受性差。

（v）腹腔注射 130 μL d-熒光素（30 mg/ml在 DPBS 中）。

（vi）15 分鐘后，在室溫下通過心臟穿刺采血，每只小鼠采集 60 μL血液到 K2EDTA 管中，采集 190 μL血液到 Minicollect 管中。

（vii）使用二氧化碳吸入法結(jié)合輔助實驗終止程序手段（頸椎脫臼法）對小鼠實施實驗終止程序。對于鞋盒式小鼠籠，二氧化碳流量需為 2.8 升/分鐘。

（viii）取出并用生物發(fā)光和熒光成像系統(tǒng)（IVIS）對器官進(jìn)行成像（胰腺、脾臟、肝臟、腎臟、卵巢、肺和心臟）。

（ix）使用 AuRA 軟件量化發(fā)光強(qiáng)度。

（B）使用 EPO mRNA LNP 測量分泌蛋白表達(dá)水平

（i）制備 EPO mRNA LNP。

（ii）向 C57BL/6 小鼠（杰克遜實驗室，18-21 克）靜脈注射 EPO mRNA LNP（每組至少 n = 3）。

（iii）在注射 EPO mRNA LNP 后總共 24 小時，通過心腔穿刺采血法在室溫下從每只小鼠采集 200 μL血液至 Minicollect 管中。

（iv）在室溫下以 1300g 離心 Minicollect 管 10 分鐘以收集血清。

（v）按照制造商的說明，使用人 EPO ELISA 試劑盒測量血清樣本中 EPO 蛋白的濃度。

（C）mRNA LNP 毒性的評估

（i）為進(jìn)行血液學(xué)檢測和肝腎功能的臨床化學(xué)檢測，將步驟B（iii）中的 Minicollect 管在室溫下以 1300g 離心 10 分鐘以收集血清。

（ii）使用 Vet Axcel 儀器，分別使用相應(yīng)的試劑盒，按照制造商的協(xié)議測量血清中 ALT、AST、ALP、BUN 或肌酐的水平。

（iii）使用 IDEXX ProCyte Dx 血液學(xué)分析儀，按照 CBC 試劑盒的說明對步驟1A（vi）中收集在 K2EDTA 管中的血液樣本進(jìn)行 CBC 檢測。

（iv）對第A（viii）步收集的器官進(jìn)行組織學(xué)檢測時，首先將組織放入金屬模具中，加入溫?zé)崾灨采w組織，并插入一個盒片以作支撐。如有需要，可再添加石蠟。將模具置于冷卻板上，直至組織塊凝固。凝固后，從金屬模具中取出組織塊，并修剪掉多余的石蠟。

（v）在切片機(jī)上將組織切成 5 微米厚的切片，置于正電荷載玻片上。

（vi）在進(jìn)行蘇木精和伊紅染色之前，將載玻片在空氣中干燥過夜，然后在 60°C 下烘烤 30 分鐘。

（vii）使用自動染色儀 XL 進(jìn)行蘇木精和伊紅染色。將切片用蘇木精染色 2 分鐘，用伊紅-Y 染色 1 分鐘。使用澄清劑 2 和藍(lán)化液來區(qū)分反應(yīng)。

（viii）染色完成后，用梯度乙醇（95%）脫水，最后用二甲苯脫水，并用細(xì)胞密封劑 60 封片。

（ix）對每個樣本進(jìn)行組織學(xué)分析，以評估細(xì)胞和組織損傷情況，并觀察任何炎癥反應(yīng)，從而幫助確定 mRNA LNP 對不同器官的安全性和潛在不良影響。

mRNA LNP 的體內(nèi)評估

步驟1A（i - ix），使用 FLuc mRNA LNP 測量生物分布和細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平：2 - 3 天

步驟1B（i - vi），使用 EPO mRNA LNP 測量分泌蛋白表達(dá)水平：2 - 3 天

步驟1C（i - ix），評估 mRNA LNP 的毒性：1 - 2 周

實驗通過向 C57BL/6 小鼠靜脈注射熒光素酶（FLuc）或促紅細(xì)胞生成素（EPO）mRNA-LNP來評估其體內(nèi)療效。

結(jié)果表明，TAT LNPs 和八精氨酸 LNPs 表現(xiàn)出較低的熒光素酶（FLuc）信號，這與裸 mRNA 和 PBS 對照組相似（圖2b、c）。

其次，TA LNPs、PEI LNPs 和 ATP LNPs 表現(xiàn)出較高的 FLuc 表達(dá)（圖2b、c）。

第三，不含任何輔料的 LNP 制劑主要在肝臟中表達(dá)。

第四，各種 mRNA LNP 制劑能夠促進(jìn)不同器官中蛋白質(zhì)的表達(dá)。

第五，分泌到血清中的促紅細(xì)胞生成素（EPO）表達(dá)量與 FLuc 表達(dá)量呈現(xiàn)相似的趨勢（圖2e）。

最后，所有 mRNA LNP 制劑均表現(xiàn)出耐受性，通過體重保持、組織學(xué)（圖2f）、全血細(xì)胞計數(shù)（CBC）血液學(xué)檢測以及檢測肝腎功能的血液檢測（圖2g），包括堿性磷酸酶（ALP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血尿素氮（BUN）和肌酐檢測進(jìn)行分析。治療組中的這些生物標(biāo)志物結(jié)果與 PBS 對照組相似。mRNA LNP 治療組與裸 mRNA 或 PBS 對照組之間未觀察到差異。總的來說，該方案通過評估 mRNA LNP 在體外和體內(nèi)的性能，有助于設(shè)計優(yōu)化的 mRNA LNP 配方，從而促進(jìn)全球范圍內(nèi) mRNA LNP 開發(fā)的研究。

參考文獻(xiàn)：Ma Y, VanKeulen-Miller R, Fenton OS. mRNA lipid nanoparticle formulation, characterization and evaluation. Nat Protoc. 2025 Mar 11. doi: 10.1038/s41596-024-01134-4. Epub ahead of print. PMID: 40069324.