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丙酮酸測定試劑盒--簡單敏感的方法,適用于各種生物樣本類型

來源:武漢艾美捷科技有限公司   2025年04月10日 16:53  

丙酮酸是細(xì)胞代謝中的關(guān)鍵分子。它是糖酵解的最終產(chǎn)物,也是需氧和厭氧呼吸的初始步驟。在需氧條件下,丙酮酸進(jìn)入線粒體,在那里它經(jīng)歷進(jìn)一步的氧化,通過克雷布斯循環(huán)和氧化磷酸化產(chǎn)生能量豐富的分子,如ATP?;蛘?,在厭氧條件下,丙酮酸可以轉(zhuǎn)化為乳酸,再生糖酵解繼續(xù)所需的輔因子NAD+。丙酮酸還作為各種生物合成途徑的關(guān)鍵前體,包括氨基酸和脂肪酸的合成。它在能量生產(chǎn)和生物合成中的核心作用使丙酮酸成為細(xì)胞過程中的基本分子。AkrivisBio丙酮酸檢測是一種簡單敏感的方法,用于定量從低于1μM10mM范圍內(nèi)的丙酮酸,適用于各種生物樣本類型。

 

艾美捷丙酮酸測定試劑盒

貨號:MA-0129

孔數(shù):100

樣本類型:組織提取物、細(xì)胞裂解物、血清、血漿、尿液、其他生物液體

物種:所有物種

檢測方法:比色法,OD 570納米或熒光法,激發(fā)/發(fā)射 = 535/580納米

檢測類型:定量

應(yīng)用:一種基于板的比色法/熒光法檢測,用于在μM - 10 mM范圍內(nèi)定量各種生物樣本中的丙酮酸。

靈敏度:1 uM-10 mM

儲存條件:-20°C

運(yùn)輸溫度:使用冰袋

 

丙酮酸測定試劑盒組分:

-檢測緩沖液25毫升WMMA-0129-A

-ADHP溶液200微升紅色MA-0129-B

-丙酮酸氧化酶/過氧化氫酶凍干綠色MA-0129-C

-丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品100微升黃色MA-0129-D

 

儲存和處理:將所有組件儲存在-20°C。使用前將其升至室溫。打開前短暫離心小瓶。

-檢測緩沖液:使用前升至室溫。儲存在4°C。

-ADHP溶液:升至室溫以融化DMSO溶液。混合均勻,儲存在-20°C。

-丙酮酸氧化酶/過氧化氫酶:加入220微升檢測緩沖液溶解。儲存在-20°C。

 

檢測方案:

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線:

a.基于吸光度的檢測(樣本中約100μM10mM):通過將10微升標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移到990微升檢測緩沖液中,將丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0.4mM。

b.基于熒光的檢測(約0.2μM100μM):通過向990微升檢測緩沖液中添加10微升標(biāo)準(zhǔn)品,然后將10微升轉(zhuǎn)移到90微升檢測緩沖液中,進(jìn)一步稀釋丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品至最終濃度0.04mM。

c.混合均勻。將0510152025微升加入96孔板中的一系列孔中。通過添加檢測緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升,為比色法檢測提供0,2,4,6,8,10納摩爾/孔的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品。(熒光法檢測為0,200,400,600,800,1000皮摩爾/孔)。

 

2.樣本準(zhǔn)備:用50微升檢測緩沖液勻漿組織(10毫克)或細(xì)胞(10^6)。以16,000Xg離心5分鐘,然后將5-50微升清澈上清液加入96孔板中的孔中。將唾液以16,000Xg離心5分鐘,然后加入10微升到孔中。可以直接向樣本孔中加入血清(10微升)。用檢測緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升。

注意:

a.血清中的LDH活性可以將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。血清樣本應(yīng)儲存在-80°C。解凍后立即使用。

b.使用10kDa旋轉(zhuǎn)柱對樣本進(jìn)行去蛋白處理,以去除可能消耗丙酮酸的酶。

c.一些樣本背景較高。因此,以雙份運(yùn)行樣本,并使用配對孔確定背景。

d.在極少數(shù)情況下,內(nèi)源性化合物可能干擾酶反應(yīng)。使用配對樣本,向其中一個(gè)測試樣本中添加內(nèi)標(biāo)(吸光度2-5納摩爾,熒光100皮摩爾),以準(zhǔn)確測量丙酮酸(下面解釋的程序)。

3.啟動反應(yīng):為要運(yùn)行的總孔數(shù)準(zhǔn)備足夠的反應(yīng)混合物。每個(gè)孔需要50微升含有以下成分的反應(yīng)混合物:

1)反應(yīng)混合物:

樣本/標(biāo)準(zhǔn)孔混合

背景對照混合

檢測緩沖液46微升(使用熒光時(shí)47.6微升)

ADHP溶液2微升(使用熒光時(shí)0.4微升)

丙酮酸氧化酶/過氧化氫酶2微升

2)向每個(gè)含有丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣本的孔中加入50微升反應(yīng)混合物。向背景孔中加入50微升背景對照混合。

4.測量:使用微孔板讀取器在室溫下通過吸光度(570納米)或熒光(激發(fā)/發(fā)射=535/590納米)監(jiān)測反應(yīng)30分鐘。

5.典型結(jié)果:

31.png

6.計(jì)算:從所有標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)中減去0標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)。繪制丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。該值將用于計(jì)算未知測試樣本中的丙酮酸。如果運(yùn)行了背景對照孔,則從每個(gè)配對未知樣本中減去背景讀數(shù)。將背景校正后的樣本信號除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。這給出了孔中的納摩爾或皮摩爾丙酮酸。

對于添加了內(nèi)標(biāo)的樣本,從未知樣本中減去添加了已知量丙酮酸的未知樣本。獲得的信號是系統(tǒng)對添加量的響應(yīng)。僅含有未知物的孔中丙酮酸的校正量={未知樣本信號/[(添加樣本信號-未知樣本信號)/添加量]}

要將孔中的量轉(zhuǎn)換為原始樣本中的丙酮酸量:

A.孔中的丙酮酸納摩爾數(shù)/加入孔中的樣本微升數(shù)=每微升樣本的丙酮酸納摩爾數(shù)。

B.每微升樣本的丙酮酸納摩爾數(shù)X樣本總體積(原始樣本+稀釋液體積)=樣本中的總丙酮酸納摩爾數(shù)

C.樣本中的總丙酮酸納摩爾數(shù)/組織毫克數(shù)(或細(xì)胞數(shù)或血清微升數(shù)等)=每毫克組織(細(xì)胞等)的丙酮酸納摩爾數(shù)。


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