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山羊體細(xì)胞外源基因轉(zhuǎn)染整合效率優(yōu)化研究

來源:威尼德生物科技(北京)有限公司   2025年04月16日 11:55  

摘要

通過系統(tǒng)優(yōu)化電穿孔參數(shù)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染比例及外源DNA濃度,顯著提升了山羊胎兒成纖維細(xì)胞中外源基因的整合效率。實驗表明,電穿孔條件為電壓150 V、脈沖時長10 ms時,轉(zhuǎn)染效率達(dá)42.5%;聯(lián)合優(yōu)化脂質(zhì)體比例(1:3)及DNA濃度(4 μg/mL)后,整合效率提升至58.3%。研究結(jié)果為高效制備轉(zhuǎn)基因山羊體細(xì)胞提供了可靠技術(shù)方案。

引言

外源基因轉(zhuǎn)染與整合效率是體細(xì)胞克隆與轉(zhuǎn)基因動物制備的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸。山羊胎兒成纖維細(xì)胞(GFb)作為核移植常用供體細(xì)胞,其基因編輯效率直接影響后續(xù)胚胎發(fā)育成功率。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法存在整合率低、細(xì)胞毒性高等問題,亟需建立穩(wěn)定高效的優(yōu)化體系。

聚焦電穿孔與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染兩大技術(shù),通過參數(shù)梯度設(shè)計,系統(tǒng)探究電壓、脈沖時長、脂質(zhì)體/DNA比例及外源DNA濃度對轉(zhuǎn)染效率的影響,并采用熒光標(biāo)記、qPCR及Southern blot驗證整合穩(wěn)定性,旨在為轉(zhuǎn)基因山羊研究提供高效、低損傷的細(xì)胞改造方案。

實驗部分

1. 材料與方法

1.1 實驗材料

細(xì)胞系:山羊胎兒成纖維細(xì)胞(GFb),取自3月齡流產(chǎn)胎兒,經(jīng)膠原酶消化法分離培養(yǎng)。

外源基因載體pEGFP-N1質(zhì)粒(某試劑),攜帶綠色熒光蛋白(GFP)及新霉素抗性基因。

儀器:威尼德電穿孔儀、威尼德紫外交聯(lián)儀、威尼德分子雜交儀。

1.2 實驗設(shè)計
實驗分為三部分:

電穿孔參數(shù)優(yōu)化:設(shè)置電壓梯度(80 V、120 V、150 V、180 V)及脈沖時長(5 ms、10 ms、15 ms),每組重復(fù)3次。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染比例優(yōu)化:脂質(zhì)體(某試劑)與DNA質(zhì)量比設(shè)為1:1、1:2、1:3、1:4,檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞存活率及GFP表達(dá)量。

DNA濃度優(yōu)化:外源DNA濃度梯度為2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL,評估整合效率與細(xì)胞毒性關(guān)系。

1.3 實驗步驟

細(xì)胞培養(yǎng)與預(yù)處理GFb細(xì)胞于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中擴增,轉(zhuǎn)染前24 h調(diào)整密度至5×10^5 cells/mL。

電穿孔轉(zhuǎn)染:取1 mL細(xì)胞懸液與4 μg質(zhì)?;旌?,加入威尼德電穿孔儀專用電擊杯,按預(yù)設(shè)參數(shù)處理,后續(xù)培養(yǎng)48 h觀察熒光表達(dá)。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染:按比例混合脂質(zhì)體與質(zhì)粒,靜置20 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)液,37℃孵育6 h更換培養(yǎng)基。

整合效率檢測

熒光顯微鏡計數(shù):統(tǒng)計GFP陽性細(xì)胞比例;

流式細(xì)胞術(shù):定量分析轉(zhuǎn)染效率;

qPCR與Southern blot(威尼德紫外交聯(lián)儀、分子雜交儀):驗證外源基因整合位點及拷貝數(shù)。

2. 結(jié)果與分析

2.1 電穿孔參數(shù)對轉(zhuǎn)染效率的影響
電壓150 V、脈沖時長10 ms時,GFb細(xì)胞存活率最高(89.2%),轉(zhuǎn)染效率達(dá)42.5%;高于180 V時細(xì)胞損傷顯著(存活率<60%)。

2.2 脂質(zhì)體/DNA比例優(yōu)化
脂質(zhì)體與DNA質(zhì)量比1:3時,GFP表達(dá)率最高(48.7%),且細(xì)胞毒性低(存活率92.1%)。

2.3 DNA濃度與整合效率關(guān)系
外源DNA濃度為4 μg/mL時,Southern blot檢測顯示單拷貝整合占比68.3%,高于高濃度組(6-8 μg/mL)的多拷貝隨機整合現(xiàn)象。

2.4 聯(lián)合優(yōu)化效果
綜合合理參數(shù)(電穿孔150 V/10 ms + 脂質(zhì)體1:3 + DNA 4 μg/mL),轉(zhuǎn)染效率提升至58.3%,且外源基因穩(wěn)定整合率提高1.8倍。

討論

電穿孔參數(shù)中適中的電壓與脈沖時長可平衡細(xì)胞膜通透性與存活率,而脂質(zhì)體比例優(yōu)化能有效提升DNA-載體復(fù)合物穩(wěn)定性。威尼德電穿孔儀的高精度脈沖控制及紫外交聯(lián)儀的均勻交聯(lián)特性,為實驗數(shù)據(jù)可靠性提供了保障。此外,某試劑脂質(zhì)體的低細(xì)胞毒性特性顯著優(yōu)于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑。

值得注意的是,外源DNA濃度過高易導(dǎo)致多拷貝隨機整合,可能干擾靶基因功能。因此,4 μg/mL為本實驗推薦閾值。

結(jié)論

通過系統(tǒng)優(yōu)化電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及DNA濃度參數(shù),本研究成功將山羊體細(xì)胞外源基因整合效率提升至58.3%,為轉(zhuǎn)基因山羊制備提供了高效技術(shù)方案。威尼德系列儀器的穩(wěn)定性能與某試劑的高兼容性是實驗成功的關(guān)鍵支撐。未來將進一步驗證該體系在大型動物基因編輯中的普適性。

參考文獻(xiàn)

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