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二抗
二抗在免疫學(xué)實驗中起著舉足輕重的作用，二抗的選擇也決定了整個實驗的成敗。實驗中在選擇二抗時必須注意以下幾點：
（1）一抗種屬來源
主要根據(jù)一抗種屬來源來決定確定二抗的類型，如一抗是小鼠來源，那二抗就買抗小鼠的即可（如羊抗小鼠、兔抗小鼠等均可）。
（2）一抗類型
二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體.
單克隆抗體的類別及亞類通常會在產(chǎn)品說明書中都會有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當是抗小鼠IgM。
如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合，或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標記實驗中尤其適合。
在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下，可以選用抗相應(yīng)物種IgG。
（3）標記物的選擇
一般來講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于western blot和ELISA，zui常用的二抗是酶標二抗，而細胞或組織標記實驗（細胞免疫化學(xué)，組織免疫化學(xué)，流式細胞術(shù)）中通常使用熒光基團標記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使用biotin/avidin檢測系統(tǒng)。
下面簡單介紹幾種二抗探針的優(yōu)缺點及其適用的實驗：
a. 酶：
主要有兩種不同的酶耦聯(lián)物，HRP和AP。比較而言，前者更經(jīng)濟、快速、穩(wěn)定，而后者較前者更為靈敏，通常情況下，HRP廣泛應(yīng)用于免疫組化，western blot和ELISA中，而堿性磷酸酶（AP）更適合于固相的免疫檢測實驗，如ELISA和western blot.
主要有兩種不同的酶耦聯(lián)物，HRP和AP。比較而言，前者更經(jīng)濟、快速、穩(wěn)定，而后者較前者更為靈敏，通常情況下，HRP廣泛應(yīng)用于免疫組化，western blot和ELISA中，而堿性磷酸酶（AP）更適合于固相的免疫檢測實驗，如ELISA和western blot.
b. 熒光基團：
FITC：FITC是廣泛使用的熒光基團，但其zui大的缺點是淬滅快，使用抗淬滅劑可以減輕。
AMCA：常用在多標記實驗中，如免疫熒光、流式細胞術(shù)。其缺點是，淬滅快，且由于肉眼不能很好的檢測其所激發(fā)的藍色熒光，因而AMCA耦聯(lián)的二抗更適用于檢測大量存在的抗原。
花青染料（Cy2,Cy3,Cy5）：Cy2比FITC更穩(wěn)定，且在表面熒光顯微鏡下，Cy2的熒光FITC更強。Cy3和Cy5比大多數(shù)熒光基團更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。二者常在共聚焦顯微實驗中作多標記。但Cy5的缺點是不能用表面熒光顯微鏡觀察，因此通常用具有遠紅外檢測器的共聚焦顯微鏡觀察。
TRITC,RRX,TR:TRITC經(jīng)常和FITC一起用于雙標記實驗中，也可以使用RRX或TR，但TR會產(chǎn)生較高
的背景。在使用裝有氪氫燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標記實驗時，RRX尤其有用，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起使用，因為RRX的發(fā)射波長在Cy2和Cy5中間，且和這兩者的重疊很少。
PE：常和FITC一起用于流式細胞術(shù)雙標記實驗。
PE：常和FITC一起用于流式細胞術(shù)雙標記實驗。
注：由于觀察熒光需要一定波長的激發(fā)光，必須根據(jù)實驗室已有的儀器可發(fā)光的波段進行選擇。
| 熒光素根據(jù)其發(fā)射波長可分為： |
| <499nm， 藍色熒光（Blue） |
| 500-549nm，綠色熒光（Green） |
| 550-584nm，黃色熒光（Yellow） |
| 585-615nm，橙色熒光（Orange） |
| 616-700nm，紅色熒光（Red） |
| >=700nm， 遠紅外熒光（Far-Red） |
幾種新型熒光基團
| 熒光基團 | 顏色 | 激發(fā)光波長（nm） | 發(fā)射光波長（nm） |
| DyLight 488 | | 493 | 518 |
| DyLight 549 | | 550 | 568 |
| DyLight 649 | | 646 | 674 |
| DyLight 680 | Near Red | 682 | 715 |
| DyLight 800 | Infrared | 770 | 794 |
n
n 熒光亮度更強
n 發(fā)光更持久 適合于熒光拍照
n 靈敏度更高
n 高信噪比、低背景
n 穩(wěn)定性更好 適用于pH4～9的各種緩沖系統(tǒng)中
c. 生物素：
生物素（biotin）可以和抗生素蛋白/鏈酶親和素（avidin/streptavidin）發(fā)生不可逆反應(yīng)而緊密結(jié)合在一起。首先加入生物素標記的二抗，在加入耦聯(lián)有酶或熒光集團的avidin或streptavidin，后者能夠結(jié)合于二抗表面的多個位點上，從而極大的放大檢測信號。
生物素（biotin）可以和抗生素蛋白/鏈酶親和素（avidin/streptavidin）發(fā)生不可逆反應(yīng)而緊密結(jié)合在一起。首先加入生物素標記的二抗，在加入耦聯(lián)有酶或熒光集團的avidin或streptavidin，后者能夠結(jié)合于二抗表面的多個位點上，從而極大的放大檢測信號。
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