摘要：

近年來，流式細胞分選和激光捕獲顯微切割技術的出現(xiàn)讓單細胞的捕獲成為可能。不過，在獲得目的細胞之后，如何與下游分析技術（如新一代測序和芯片）銜接呢？單個細胞只含有pg級的DNA，細菌更是只有fg級的DNA，但測序或芯片分析通常需要μg甚至mg級的DNA。怎么辦？讓全基因組擴增來幫忙！

在細胞分析中，我們往往采用細胞群體，來獲取某個參數(shù)的平均值。然而，隨著細胞生物學的發(fā)展，我們逐漸意識到，平均值已不再能滿足我們的要求。對于一些復雜的組織，群體性研究只能獲得某些數(shù)量上占優(yōu)勢的細胞信息，比如高度異質性的實體瘤組織。同時，還有一些細胞的量極少，如產前診斷中的胎兒細胞或循環(huán)腫瘤細胞。當然，別忘了自然界還存在各種各樣的微生物。其中，大部分微生物不僅數(shù)量有限，也無法用傳統(tǒng)的方法擴大培養(yǎng)。對于這些微量細胞的分析，常規(guī)的技術顯然束手無策。

全基因組擴增（whole gemome amplification）是對全部基因組序列進行非選擇性擴增的技術，其目的是在沒有序列偏向性的前提下大幅度增加DNA的總量。之前人們常用基于PCR的擴增方法（如DOP-PCR和PEP-PCR），但這些方法不能對各個片段進行均勻地擴增，有可能產生擴增假象。因此，目前人們多采用多重置換擴增（MDA）方法。

號稱基因組復印機的QIAGEN REPLI-g試劑盒正是基于多重置換擴增技術，對有限的樣品進行快速、均勻、無偏向的等溫全基因組擴增，從而獲得更多遺傳信息。原理是什么？請看圖1。

圖1. 多重置換擴增（MDA）技術

在擴增過程中，引物與模板DNA 退火，并利用在DNA 模板鏈上移動的Phi 29 聚合酶在30°C 延伸，取代互補鏈，同時自身成為復制的模板。與PCR 擴增不同，MDA 不需要不同的溫度，且zui終的片段非常長（2-70 kb），突變率低。

之前QIAGEN已有多款REPLI-g試劑盒，而新品REPLI-g Single Cell Kit則是專為單細胞研究人員而設計的。與之前的試劑盒相比，它有兩點不同：采用優(yōu)化配方的高保真Phi 29 聚合酶；增加了UV去污染步驟。

REPLI-g sc 聚合酶是高保真Phi 29 聚合酶的優(yōu)化配方，具有強的置換活性，可通過多重置換擴增（MDA）擴增復雜的基因組DNA，而溫和的堿變性步驟可防止DNA 片段化并產生脫堿基位點。Phi 29 聚合酶確保了基因座的均勻擴增，它zui多能復制70 kb 而不與基因組DNA 模板解離，實現(xiàn)了基因座的均勻擴增。Phi 29 聚合酶有著3’ → 5’ 的核酸外切酶校正活性，在復制時其保真度比Taq DNA 聚合酶高出1000 倍，從而避免了擴增偏向或突變。相比之下，那些基于PCR的擴增方法會導致擴增片段短且容易出錯，帶來單堿基對突變、STR縮小和擴大。

同時，REPLI-g Single Cell Kit 使用專門的緩沖液和試劑，反應設置相當簡單，且處理時間僅為15 分鐘。這些*的組分，再加上標準化的UV 處理步驟，能夠消除任何可檢測到的殘留DNA污染，確保高質量結果僅僅來自您那個寶貴的細胞。此試劑盒也可使用已純化的基因組DNA、新鮮或干燥的血液，以及新鮮或冷凍的組織。

表1. REPLI-g Single Cell Kit的組分

這下，哪怕只有一個細胞在手，您也可以大膽地開展各種下游分析了吧。經REPLI-g Single Cell擴增后，DNA產物平均長度超過10 kb，產量高達40 μg，且完整覆蓋基因組，高度適合也已經開發(fā)用于新一代測序（NGS）、芯片法比較基因組雜交（array CGH）或qPCR分析。

圖2. 完整的基因組覆蓋。利用RT2 qPCR Primer Assays（QIAGEN）以及REPLI-g Single Cell Kit 在3 個不同的單細胞實驗中擴增DNA 后開展實時定量PCR，對整個人類基因組中分布在不同染色體上的267 個基因座進行全面分析。低且一致的CT 值、無任何標記的丟失，表明基因組中所有區(qū)域的成功擴增，高度適合單細胞基因組學。

當然，事實勝于雄辯。東西好不好，用過了才有發(fā)言權。好吧，現(xiàn)在請客戶來發(fā)言。

*位是華大基因研究員宋盧挺。他之前一直用REPLI-g mini kit，這一次評估了REPLI-g Single Cell Kit。他選用正常的淋巴細胞系樣品，分別做了1個無擴增的大量細胞（>1000000個）、1個Qiagen REPLI-g single cell kit單細胞、3個Qiagen REPLI-g mini kit單細胞、1個Qiagen REPLI-g mini kit多細胞（約15細胞）樣品的約0.5x全基因組測序。

他認為，相對于原REPLI-g mini kit，新的single cell kit可極大地降低擴增偏向性，實現(xiàn)全基因組較均一的擴增（接近無擴增的效果），使此試劑盒產物有了同時可檢測SNP和CNV、SV的可能性。但在Mean Mapping Quality、Read mapping ratio、Read duplicated ratio等數(shù)據方面，因原REPLI-g mini kit效果已較好，無變化。

第二位是新加坡基因組研究院的Masafumi Muratani 博士。他談道：“我已經試過了這個試劑盒，并成功開展了單細胞全基因組擴增。所獲得的DNA 讓我能可靠檢測一個結腸直腸癌細胞系中等位基因特異的點突變。擴增后DNA 的出色產量和序列代表性確實幫助我推進了單細胞基因組學的研究工作。”

有了身邊這兩位研究人員的現(xiàn)身說法，現(xiàn)在您應該充滿信心了吧。如果您恰好在從事癌癥研究或宏基因組學研究，那么不妨試試這個新產品。