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MC3T3細(xì)胞相關(guān)操作

來源:北京艾澤信科技有限公司   2013年09月14日 22:02  

MC3T3細(xì)胞相關(guān)操作:

培養(yǎng)條件:

每兩天換液一次

無菌恒溫培養(yǎng)箱

37

5% CO2

PH7.2~7.4

*培養(yǎng)基成分不含酚紅 α-MEM、10% FBS, 0.1 mg/mL L-谷氨酸鹽, and 1% 雙抗(100 U ml−1 青霉素 and 100 μg ml−1 鏈霉素),( 20 mM HEPES?)

誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化:上述+50 μg/mL 抗壞血酸and 10 5?)mM β-磷酸甘油

細(xì)胞復(fù)蘇

1.37°C水浴預(yù)熱培養(yǎng)基(αMEM+10% FBS);

2.從液氮中取出細(xì)胞迅速放入37°C水浴快速解凍(解凍后不要繼續(xù)暖細(xì)胞);

3.在超凈臺中加入5ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,1000rpm離心5min;

4.棄上清,加入5ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)入T25培養(yǎng)瓶中,輕輕晃勻;

5.置于37°C5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)瓶蓋沒有透氣孔的話,瓶蓋不要擰太緊;

6.第二天,用新鮮的培養(yǎng)基給細(xì)胞換液后繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代

1.當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時,給細(xì)胞傳代;

2.37°C水浴預(yù)熱培養(yǎng)基(αMEM+10% FBS);

3.在超凈臺中,棄培養(yǎng)基,加入2-5mlPBS清洗細(xì)胞后,再加入1ml胰酶消化細(xì)胞;

4.顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓,有細(xì)胞開始脫離瓶壁時,加入5ml培養(yǎng)基(αMEM+10% FBS)終止消化;

5.用移液器輕輕吹下瓶壁上剩余的細(xì)胞,并輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞吹散;

6.將細(xì)胞移入離心管中,1000rpm離心5min

7.棄上清,加入15-20ml的培養(yǎng)基(含血清)重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)入T75培養(yǎng)瓶中或按適當(dāng)比例傳到T25瓶中(確保細(xì)胞貼壁后融合度在25-50%之間),細(xì)胞密度在1×104 cells/cm2 (2.5×105 cells/T-25瓶),混勻細(xì)胞懸液,確保細(xì)胞均勻分布;

8.將培養(yǎng)瓶置于37°C5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法:

培養(yǎng)基:D-MEM低糖450 mL)、10%FBS50ml)、10mg/mL慶大霉素(250ul)、0.1 mg/mL L-谷氨酸鹽

無菌恒溫培養(yǎng)箱

37

5% CO2

1、接種細(xì)胞后,每48h更換一次培養(yǎng)基。每周傳代兩次,傳代時機(jī)選在分裂率為1314時進(jìn)行。通常試驗(yàn)選用3-8傳代細(xì)胞。

2、細(xì)胞鑒定:

①第四傳代,去除培養(yǎng)基,加入3 ml of 0.25% (重量/體積) 胰蛋白酶/0.02% (重量/體積) EDTA,室溫下消化3min。沖洗細(xì)胞,加入1 mlPBS48℃),4℃下300g離心8min,離心兩次。每個離心管中用100ulPBS懸浮1×106個細(xì)胞,使用抗鼠FITC標(biāo)記Sca-1, CD11b and CD45抗體染色,或者是PE標(biāo)記  CD29, CD31, CD34, CD44, CD86, CD105, Ia抗體染色,留一管用作對照。

②細(xì)胞在暗環(huán)境下于4℃環(huán)境中染色30min

③沖洗細(xì)胞,加入1 mlPBS48℃),4℃下300g離心8min,離心兩次。

④為了評估細(xì)胞生活狀況,在300ulPBS中加入PI0.6 µg 每百萬細(xì)胞),加入細(xì)胞中,室溫暗環(huán)境下孵育15min。

⑤采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。使用FL1、FL2發(fā)射通道。每個樣本收集201,000個事件。

3、成骨細(xì)胞分化:

①第四傳代,去除培養(yǎng)基,加入3 ml of 0.25% (重量/體積) 胰蛋白酶/0.02% (重量/體積) EDTA,室溫下消化3min。

24孔每孔接種1 × 104 個細(xì)胞。培養(yǎng)基為α-MEM,10% (體積分?jǐn)?shù)) FBS, 10 − 7 M 地塞米松, 10 mM β-甘油磷酸鈉 and 50 µM 2-磷酸抗壞血酸鹽,每孔培養(yǎng)基500ul。

③每周更換兩次培養(yǎng)基,培養(yǎng)2-4周,該期間細(xì)胞不傳代

14天后,使用Alkaline Phosphatase Kit6孔板上測定ALP活性。

⑤再培養(yǎng)14d

von Kossa染色評估礦化情況,每孔將培養(yǎng)基替換為多聚甲醛,處理30min

⑦每孔用3ml蒸餾水沖洗3min,共沖洗3

⑧每孔以300 µl,5%wt/vol)硝酸銀溶液染色,在光下孵育30min

⑨每孔用3ml蒸餾水沖洗3min,共沖洗3

10吸凈水,每孔加入300 µl,5% (wt/vol)硫代硫酸鈉溶液,處理5min

11每孔用3ml蒸餾水沖洗3min,共沖洗3

                           艾澤信:www.ai-zx.com

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