英文名稱： MTT
中文名稱： 噻唑蘭
MF： C18H16BrN5S
MW： 414.32
CAS： 298-93-1
實驗方法明確問題
⒈選擇適當?shù)募毎臃N濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細胞數(shù)呈的線性關系。否則細胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。
⒉藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。
⒊ 時間點的設定。在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，zui后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應該就是的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現(xiàn)的zui明顯）。
⒋培養(yǎng)時間。200ul的培養(yǎng)液對于10的4～5次方的增殖期細胞來說，很難維持68h，如果營養(yǎng)不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換液的。
⒌MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細胞數(shù)。做MTT時，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。
⒍理論未必都是對的。要根據(jù)自己的實際情況調(diào)整。
⒎實驗時應設置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。
⒏避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞時，高的血清物質(zhì)會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。步驟把握
MTT 溶液的配制方法
通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器用鋁箔紙包住。
需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細胞數(shù)。在用酶標儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實驗結(jié)果的線性，MTT 吸光度在0-0.7 范圍內(nèi)。
MTT一般現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4℃避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時就不能再用了。
MTT有致癌性，用的時候小心，有條件帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.
配制MTT時用用PBS溶解，也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。
PBS配方：
Nacl 8g
Kcl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
調(diào)pH 7.4
定容1L
MTT用途及原理
MTT主要有兩個用途：
1．藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體外培養(yǎng)的細胞毒性的測定；MTT原理：
檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲臜，用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值（OD值），來判斷活細胞數(shù)量，OD值越大，細胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越?。?。
貼壁細胞
1、收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測細胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。
⒉、5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度，每孔100ul，設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況
⒊、5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。
5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。
6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
7、同時設置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）  mtt
懸浮細胞
1、收集對數(shù)期細胞，調(diào)節(jié)細胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 （儲存液100mg/ml，需預試尋找*稀釋度，1:10-1:20）；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100ml 1640）。
2、置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4，直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）
4、離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。
接種（鋪板)
細胞過了30代以后就不要用了，因為狀態(tài)不好了；培養(yǎng)板要用好的（進口板），不好的板或重復利用的板只可做預實驗。
接種時按照預實驗摸索出的密度接種，因為細胞密度在10000/ml左右時，所測得的OD值的區(qū)間即細胞抑制率（或者增值率）的所呈現(xiàn)的線性關系，結(jié)果zui可信。如果鋪的太稀細胞的殺傷不會很明顯，太密細胞可能都會凋亡，因為細胞長的太快營養(yǎng)會不夠，zui后導致死亡。且而細胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關系不佳。故而MTT細胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。
細胞密度要根據(jù)不同細胞的特點來定.如果你做的藥品對細胞具有刺激作用那么取小點的細胞濃度，如果你做的藥品對細胞具有抑制作用那么取大點的細胞濃度，這樣與對照的區(qū)別更明顯，數(shù)據(jù)更好。懸浮細胞每孔的細胞數(shù)可達到105，貼壁細胞可為103-104.
其它的聲音
⒈首先細胞的接種密度一定不能過大，一般每孔1000個左右就夠了，我認為寧少勿多。尤其是對于腫瘤細胞。10000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現(xiàn)不出的，*點板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會很大。
⒉MTT本身就是比較粗的實驗，增殖率10%左右的波動都不算奇怪。特別是新手，20%的波動也是常見的，所以很可能是技術原因引起的，特別是種板技術一定要過關。
⒊我做的是腫瘤細胞的MTT實驗，這種細胞長的很快一開始我是用100000/ML的濃度來接種的，結(jié)果細胞長的太滿結(jié)果是沒有梯度也沒有線性關系.后來調(diào)整濃度，用過40000~80000/ML的濃度都做過MTT實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)做的結(jié)果比較好點的是60000~70000/ML的濃度組的.用40000/M的濃度的組，由于細胞少，藥物作用的梯度還是有，只是沒有很好的線性關系.還有根據(jù)細胞生長速度以及藥物的特性（有時間依賴性和濃度依賴性的藥物）來確定培養(yǎng)時間是48小時還是72小時.
注意細胞懸液一定要混勻，已避免細胞沉淀下來，導致每孔中的細胞數(shù)量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管得多，但是如果操作不熟，CV會在8%左右。另外，吹散次數(shù)過多也會影響細胞活力。所以要熟練些、快些上板。

2．細胞增殖及細胞活性測定。