mRNA差異顯示技術(shù)（differential display，DD）是用于研究基因的差異表達的新方法。該技術(shù)自1992年被報道后，即以其不可替代的優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在應(yīng)用過程中不斷得到改進，并產(chǎn)生了諸多衍生技術(shù)如RPA（RNA finger printing by arbitrarily primed PCR）、GDD（genomic DD）等。本文簡要介紹在本試驗室熒光標(biāo)記差異顯示技術(shù)（fluorescent DD，F(xiàn)DD）的應(yīng)用及體會。

1.材料與方法

1.1 標(biāo)本

人單核細胞系U937，細胞密度2×10⁸/L，分對照組（N）、處理Ⅰ組（T1）、處理Ⅱ組（T 2），N用1640培養(yǎng)基及10%胎牛血清培養(yǎng)，T1用IFN-γ104U/L LPS 1μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0μg/L分別刺激7h.

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol試劑（GIBCO BRL）、Fluoro DD試劑盒（Genomyx）、Supersript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶（GIBCO  BRL）、Ampli Taq DNA聚合酶（GIBCO BRL）、RNase-free DNaseI（Promega）；Genomyx LR 、 Genomyx SC、DNAThermal Cycler（Perkin Elmer）

1.3 總RNA的制備

按試劑盒提供的方法分別提取三種細胞的總 RNA,以 RNase-free DNase I（終濃度80 000 U/L）除去其中污染的 DNA,經(jīng)甲醛變性凝膠電冰鑒定其完整性，并以紫外分光光度計檢 測其純度

1.4 mRNA差異顯示

1.4.1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

選擇錨定引物[T7（dT12）AP（anchored prime rs，AP）]，序列為5'ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3'，其中 M=A/G/C。N=A /G/C/T],以總RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，每管反應(yīng)體系如下：總RNA l.0μg，AP 4 pmol ，70℃ 5 min，加入50 mmol/L Tris-HCl（pH8.3），75 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl₂，10mmol /L DTT，25μmol/L，dNTPmix（1∶1∶1∶1），SuperScriptⅡ 60 Units，總反應(yīng)體系20 μl ，42℃ 5 min，50℃ 50 min，70℃ 15 min。

1.4.2 熒光標(biāo)記差異顯示PCR 

選取與逆轉(zhuǎn)錄引物序列相同的帶熒光物 質(zhì)標(biāo)記的錨定引物[TMR-T7（dT12）AP]，隨機引物（5'ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3'），以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括：20 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），50 mmol/L KCl,3.75 mmol/L MgCl₂，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3.0 μl，50 μ mol/L dNTP mi x（1∶1∶1），0.35 μmol/L 5'-隨機引物，0.35 μmol/L 3-錨定引物，Ampli Taq 0.5 U nits，總反應(yīng)體系10 μl。反應(yīng)步驟如下：95℃ 2 min；94℃ 15 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，4個循環(huán)； 94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，個循環(huán)；72℃延伸7 min。

1.4.3 分離差異顯示片段

配制5.6%變性聚丙烯酰胺凝膠，膠厚0.2 5 mm，大小61×33 cm。將PCR產(chǎn)物加4.0μl上樣緩沖液，95℃變性后上樣。3000V、100W 、55℃電泳4.5 h。干膠后置于Genomyx SC掃描，用系統(tǒng)所帶的AcquireSC program軟件分 析處理掃描結(jié)果。

1.4.4 回收差異條帶

用AcquireSC軟件將差異條帶定位，用一次性手術(shù)刀片切割下所需條帶，置于30μl去離子水中，37℃水浴30-60 min，備用。

1.4.5 差異條帶的再擴增

以經(jīng)上述處理的回收條帶為模板，T7啟動子22-mer（5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3’）、反M13（-48）24-mer（5'AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3'）為引物，進行再擴增反應(yīng)：模板2.0μl，20 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2,20 μmol/L dNTP mix（1∶1∶1∶1），0.2 μmol/L T7、0 .2 μmol/L M13-r、AmpliTaq 1.0 U nits，總反應(yīng)體系20 μl.反應(yīng)條件同差異顯示PCR。

2.結(jié)果

2.1 總RNA的質(zhì)量

總RNA經(jīng)Dnase I處理，用1.0%甲醛變性凝膠電泳，可見清楚的28 S、18 S、5 S條帶，且28 S/18 S約為2∶1（圖1），表明RNA完整性好，無降解現(xiàn)象。N、T1、T2的OD260/OD28 0比值分別為1.92、1.83、1.98，表明樣品純度高。

Fig.1 Result of total RNA on formaldehyde-agarosegel

2.2 熒光標(biāo)記mRNA差異顯示

結(jié)果顯示每一泳道均有約50條大小不等的擴增產(chǎn)物，各組間比較見較多呈有無或強弱變 化的差異條帶，圖2中箭頭所示。

Fig.2 Analysis of gene expression of cells treated with IFN and LPS by differential display technique

2.3 差異條帶再擴增

取T2中約1.25Kb的條帶再擴增，結(jié)果見圖3.

Fig.3 Reamplification result of differ entially expressed

band DNA marker is 200 bp ladder （200 bp~2 kb），1.0kb is arro wed

3. 討論

基因表達是調(diào)節(jié)細胞生物學(xué)行為的核心。探討處于不同生理、病理狀態(tài)下的有機體之間 的未知表達基因的差異，是研究生命本質(zhì)的有效途徑。1992年報道的真核細胞mRNA差異顯示技術(shù)，為檢測未知的表達基因提供了一種新的途徑。DD技術(shù)具有快速、敏感、 可同時檢測兩組或以上的組織或細胞、RNA用量少、可檢測某一表達基因的有無或其表達的強弱等優(yōu)點，一經(jīng)問世即受到許多領(lǐng)域的重視并得以廣泛應(yīng)用。然而，該技術(shù)也存在著一些缺陷，主要表現(xiàn)為：cDNA產(chǎn)物的質(zhì)量較低，在序列膠中往往呈不清晰狀態(tài)；所得的cDNA片段通常小于500nt，往往是3'-端的非翻譯（編碼）序列；所得差異片段的假陽性高，可高達85%等。

熒光標(biāo)記差異顯示技術(shù)通過對引物設(shè)計、PCR條件、凝膠、電泳條件以及標(biāo)記物的改進，極大減少了上述不足。

差異顯示的錨定引物有單堿基錨定引物、簡并或非簡并的雙堿基錨定引物等多種類型，本實驗通過使用雙堿基錨定引物，將總mRNA群體分為12個亞群，這極大減小了每一錨定引物 產(chǎn)生的*條cDNA鏈的數(shù)量，不僅可降低隨機引物的用量，更可降低DD產(chǎn)物的復(fù)雜性，使差示條帶在序列膠上易于分辨，從而傳統(tǒng)方法中常見的“重疊帶”現(xiàn)象減少。DD的隨機引物的特點為A+T與G+C含量近乎相等，且3'-端以G或C結(jié)尾，可增加DD擴增的效率。通過改變RT-PCR反應(yīng)條件如底物濃度、延伸時間等，差異片段的長度可達1.0-1.5 kb（圖2）， 因較長的cDNA片段容易通過Northern blot 進行分析鑒定辨別真假陽性克隆，且其中可提供更多的序列信息，故獲取大的片段具有重要的意義。

文獻認為差異顯示居高不下的假陽性率實際上因再擴增所致。通常， 再擴增的引物與DD引物相同，本試驗將再擴增引物設(shè)計為T7（22-mer）與M13-r（24-mer），此為在錨定引物的5' 端和隨機引物的3' 端分別增加的序列（本文方法中所列差異顯示引物序列的 劃線部分），這兩種來源于原核生物的引物盡可能降低了在真核mRNA序列中非特異性擴增的機會。同時，T7啟動子序列可直接用于體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA探針，為cDNA片段的直接測序和鑒定（RPA或Northern分析）提供了方便。

用常規(guī)的序列分析膠進行分辨時，較長的cDNA片段往往擠在膠的上端而影響分辨率。本 操作改用5.6%的PAGE膠（聚丙烯酰胺），減少膠的厚度（僅250μm），通過提高電泳的電壓（3000 V）及溫度（55℃），可顯著提高分辨率。

同位素標(biāo)記存在曝光時間長、帶型不佳，基本與相鄰的帶混合、污染等缺點，將熒光物 質(zhì)標(biāo)記于錨定引物的5’端，可產(chǎn)生清晰、明亮、低背景的分辨效果，操作周期僅兩天。

目前，DD技術(shù)己被廣泛應(yīng)用于與疾病、衰老、生殖、生長發(fā)育、分化等生理 、病理過程相關(guān)的未知表達基因的研究，相信對揭示生物界基因表達調(diào)控的奧秘將起重要的作用。

1.4.5 差異條帶的再擴增

以經(jīng)上述處理的回收條帶為模板，T7啟動子22-mer（5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3’）、反M13（-48）24-mer（5'AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3'）為引物，進行再擴增反應(yīng)：模板2.0μl，20 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl₂，20 μmol/L dNTP mix（1∶1∶1∶1），0.2 μmol/L T7、0 .2 μmol/L M13-r，AmpliTaq 1.0 Units，總反應(yīng)體系20μl。反應(yīng)條件同差異顯示PCR。

2. 結(jié)果

2.1 總RNA的質(zhì)量

總RNA經(jīng)Dnase Ⅰ處理，用1.0%甲醛變性凝膠電泳，可見清楚的28 S、18 S、5 S條帶 ,且28 S/18 S約為2∶1（圖1），表明RNA完整性好，無降解現(xiàn)象。N、T1、T2的OD260/OD280比值分別為1.92、1.83、1.98，表明樣品純度高。

Fig.1 Result of total RNA on formaldehyde-agarosegel

2.2 熒光標(biāo)記mRNA差異顯示

結(jié)果顯示每一泳道均有約50條大小不等的擴增產(chǎn)物，各組間比較見較多呈有無或強弱變化的差異條帶，圖2中箭頭所示。

Fig.2 Analysis of gene expression of cells treated with IFN and LPS by differential display technique

2.3 差異條帶再擴增

取T2中約1.25Kb的條帶再擴增，結(jié)果見圖3。

Fig.3 Reamplification result of differ entially expressedband DNA marker is 200 bp ladder （200 bp~2 kb），1.0kb is arro wed

3. 討論

基因表達是調(diào)節(jié)細胞生物學(xué)行為的核心。探討處于不同生理、病理狀態(tài)下的有機體之間 的未知表達基因的差異，是研究生命本質(zhì)的有效途徑。1992年報道的真核細胞mRNA差異顯示技術(shù)，為檢測未知的表達基因提供了一種新的途徑。DD技術(shù)具有快速、敏感、 可同時檢測兩組或以上的組織或細胞、RNA用量少、可檢測某一表達基因的有無或其表達的 強弱等優(yōu)點，一經(jīng)問世即受到許多領(lǐng)域的重視并得以廣泛應(yīng)用。然而，該技術(shù)也存在著一些 缺陷，主要表現(xiàn)為：cDNA產(chǎn)物的質(zhì)量較低，在序列膠中往往呈不清晰狀態(tài)；所得的cDNA片段通常小于500nt,往往是3'-端的非翻譯（編碼）序列；所得差異片段的假陽性高，可高達85%等。

熒光標(biāo)記差異顯示技術(shù)通過對引物設(shè)計、PCR條件、凝膠、電泳條件以及標(biāo)記物的改進，極大減少了上述不足。

差異顯示的錨定引物有單堿基錨定引物、簡并或非簡并的雙堿基錨定引物等多種類型，本實驗通過使用雙堿基錨定引物，將總mRNA群體分為12個亞群，這極大減小了每一錨定引物產(chǎn)生的*條cDNA鏈的數(shù)量，不僅可降低隨機引物的用量，更可降低DD產(chǎn)物的復(fù)雜性，使差示條帶在序列膠上易于分辨，從而傳統(tǒng)方法中常見的“重疊帶”現(xiàn)象減少。DD的隨機引物的特點為A+T與G+C含量近乎相等，且3' 端以G或C結(jié)尾，可增加DD擴增的效率。通過改變RT-PCR反應(yīng)條件如底物濃度、延伸時間等，差異片段的長度可達1.0-1.5 kb（圖2），因較長的cDNA片段容易通過Northern blot 進行分析鑒定辨別真假陽性克隆，且其中可提供更多的序列信息，故獲取大的片段具有重要的意義。

文獻認為差異顯示居高不下的假陽性率實際上因再擴增所致。通常， 再擴增的引物與DD引物相同，本試驗將再擴增引物設(shè)計為T7（22-mer）與M13-r（24-mer），此為在錨定引物的5' 端和隨機引物的3' 端分別增加的序列，這兩種來源于原核生物的引物盡可能降低了在真核mRNA序列中非特異性擴增的機會。同時，T7啟動子序列可直接用于體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA探針，為cDNA片段的直接測序和鑒定（RPA或Northern分析）提供了方便。

用常規(guī)的序列分析膠進行分辨時，較長的cDNA片段往往擠在膠的上端而影響分辨率。本操作改用5.6%的PAGE膠（聚丙烯酰胺），減少膠的厚度（僅250μm），通過提高電泳的電壓（3000 V）及溫度（55℃），可顯著提高分辨率。

同位素標(biāo)記存在曝光時間長、帶型不佳，基本與相鄰的帶混合、污染等缺點，將熒光物質(zhì)標(biāo)記于錨定引物的5' 端，可產(chǎn)生清晰、明亮、低背景的分辨效果，操作周期僅兩天。

目前，DD技術(shù)己被廣泛應(yīng)用于與疾病、衰老、生殖、生長發(fā)育、分化等生理 、病理過程相關(guān)的未知表達基因的研究，相信對揭示生物界基因表達調(diào)控的奧秘將起重要的作用。