國(guó)立中國(guó)臺(tái)灣大學(xué) 生化科技學(xué)系 生化研究室 莊榮輝

基礎(chǔ)免疫學(xué)：

A）脊椎動(dòng)物體內(nèi)有催毀外來入侵物體的免疫系統(tǒng)：

免疫反應(yīng)可分成先天及后天兩大系統(tǒng)，又各有兩種方式，分別以細(xì)胞或分子去掃除入侵物。 當(dāng)入侵物太多時(shí)，即由先天免疫系統(tǒng)誘發(fā)后天免疫，開啟了更有效率、更為強(qiáng)大的防御機(jī)制。

干擾素： 遭病毒攻擊的細(xì)胞會(huì)放出干擾素，干擾素會(huì)活化免疫系統(tǒng)。

溶菌： 在體表及淚液中溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。

巨噬細(xì)胞： zui基層的免疫細(xì)胞，是免疫系統(tǒng)的*線防御。

自然殺手細(xì)胞： 可清除體內(nèi)的癌細(xì)胞，是免疫監(jiān)視系統(tǒng)。

B）后天免疫反應(yīng)的四個(gè)階段：

遭遇： 巨噬細(xì)胞把抗原分解成小片段，專一地表現(xiàn)給T_H細(xì)胞。

動(dòng)員： T_H細(xì)胞動(dòng)員T_K細(xì)胞及B細(xì)胞，后者生產(chǎn)專一性抗體。

掃蕩： 抗體及T_K細(xì)胞攻擊入侵的抗原。

休止： 完成清除抗原后，免疫細(xì)胞休息。

C）后天免疫反應(yīng)的兩大特點(diǎn)：

專一性： 由 甲抗原 所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)只對(duì) 甲抗原 有效。

記憶性： *后若 甲抗原 再度入侵，可迅速動(dòng)員掃蕩之。

D）抗體是由B細(xì)胞所分泌的蛋白質(zhì)：

抗體分子： 由四條蛋白質(zhì)長(zhǎng)短煉所組成 （兩重兩輕）。

結(jié) 合 區(qū)： 抗體分子上有兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū) （二者相同）。

專 一 性： 抗體與抗原結(jié)合 專一性 （如lock & key般吻合）。

抗體種類： IgG是單一抗體分子，另有IgM （五元體） 及IgA （二元體）。

為何要使用單株抗體： 

1） 抗原分子上可以誘導(dǎo)出抗體的部位或片段，特稱之為 抗原決定基 （antigenic determinant）；一個(gè)抗原分子上通常都有許多處抗原決定基，而每個(gè)決定基至少都可誘生出一種抗體；因此在傳統(tǒng)抗血清中，都含有許多種不同的抗體，分別對(duì)抗這些不同的決定基。

2） 對(duì)于分子構(gòu)造相似的抗原，由于它們含有共同或相似的抗原決定基，所產(chǎn)生的抗血清對(duì)這兩種相似的抗原都會(huì)產(chǎn)生反應(yīng)；因此在檢定此類抗原時(shí)，其 專一性 不很理想，常常會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，也稱為 交叉反應(yīng)性。 同時(shí)又由于免疫動(dòng)物的個(gè)別體質(zhì)不同，對(duì)抗原的反應(yīng)也有相當(dāng)?shù)牟町?，以致無法準(zhǔn)確控制所得到每批抗血清 效價(jià) 的高低。

3） 血清中的每一種抗體是由單一個(gè)B細(xì)胞所分泌產(chǎn)生，若能把此B細(xì)胞由脾臟中挑出來，單獨(dú)培養(yǎng)成細(xì)胞株，則可得單一種類的抗體，只會(huì)對(duì)一種 抗原決定基 反應(yīng)，其專一性*。 大量培養(yǎng)此細(xì)胞株，即可有質(zhì)量一定、純度均一的抗體，此即為 單株抗體。

4） 然而B細(xì)胞不易在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，雖然有人一直努力，想找出在體外培養(yǎng)脾臟細(xì)胞的條件，但結(jié)果均不甚理想，因此上述想法不易達(dá)成。 

5） 癌細(xì)胞的生長(zhǎng)不受控制，很容易在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，有很多已經(jīng)建立好的癌細(xì)胞株，其生長(zhǎng)特性均已了解； 若把癌細(xì)胞永續(xù)生長(zhǎng)的特性，利用細(xì)胞融合法導(dǎo)入可生產(chǎn)有用抗體的B細(xì)胞中，則得到可在培養(yǎng)基中*生長(zhǎng)的B細(xì)胞株，此即 融合瘤 細(xì)胞株。 

6） 廣義來說，細(xì)胞融合也可說是 基因重組 的一種，它是以融合兩種不同遺傳特性的細(xì)胞，來達(dá)成改變遺傳形質(zhì)的目的。 另外，微生物或植物的細(xì)胞，亦可以 原生質(zhì)體 的形式互相融合，以改變其遺傳性質(zhì)。

細(xì)胞融合法： 實(shí)際操作流程請(qǐng)參考 水稻蔗糖合成脢之研究

利用polyethylene glycol （PEG） 進(jìn)行小白鼠 脾臟細(xì)胞 與 骨髓癌細(xì)胞 融合，經(jīng)過 篩選 及 單株化 后，可得到分泌有單株抗體的融合瘤細(xì)胞。

A）小白鼠免疫及脾臟細(xì)胞：

小白鼠 （BALB/c） 先以目標(biāo)抗原 （如菌體） 免疫，抗原需加 佐劑 （adjuvant） 制成乳劑，打入小鼠體內(nèi)慢慢釋出，誘使B細(xì)胞成熟增殖并生產(chǎn)抗體，然后取出脾細(xì)胞 （大多為B細(xì)胞） 與骨髓癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。近來有人直接取出健康的脾細(xì)胞，在試管中加入抗原進(jìn)行體外免疫；或打開腹腔直接在脾臟注射抗原免疫。 但除非抗原來源困難或有其它目的，一般仍實(shí)行舊法，因免疫反應(yīng)的啟動(dòng)機(jī)制非常復(fù)雜，不單是靠脾臟而已。

B）骨髓癌細(xì)胞 （NS-1）：

NS-1是穩(wěn)定的小白鼠BALB/c癌細(xì)胞株，除了能在培養(yǎng)基中永續(xù)生長(zhǎng)外，尚有一重要特性，其細(xì)胞缺乏兩種核酸代謝的重要酵素 （TK, thymidine kinase及HGPRT, hypoxanthine-guanine phospho ribosyltransferase）。一般細(xì)胞內(nèi)的核酸合成路徑有兩條，如下圖 （1） 及 （2） 所示：

核酸的 正常代謝途徑 （1） 若被aminopterin阻礙，可由 （2） 救急途徑 （salvage pathway） 取用thymidine及hypoxanthine來合成DNA。 但NS-1缺乏TK及HGPRT兩種酵素，因此在aminopterin存在下，NS-1無法生長(zhǎng)；正常細(xì)胞 （如B細(xì)胞） 則可經(jīng)由 （2） 救急途徑 繼續(xù)生長(zhǎng)。 HAT培養(yǎng)基因含有aminopterin, thymidine及hypoxanthine，NS-1在HAT中無法生長(zhǎng)，除非經(jīng)由細(xì)胞融合導(dǎo)入TK及HGPRT兩酵素的基因 （可由正常脾臟細(xì)胞得來）。
C）細(xì)胞融合：

小白鼠脾臟細(xì)胞⊕與NS-1細(xì)胞⊙以PEG進(jìn)行融合，操作在10 min內(nèi)完成，隨即把細(xì)胞平均分配在96槽細(xì)胞培養(yǎng)盤中。由于融合是隨機(jī)的，故可能的組合有：⊕-⊙, ⊕-⊕, ⊙-⊙, ⊕-⊕-⊕, ⊕-⊕-⊙....；只有同時(shí)含有⊕與⊙的融合細(xì)胞才會(huì)活下去：

1）   若只含NS-1 （⊙, ⊙-⊙.....），則在HAT中會(huì)因DNA合成抑制而死亡。

2）   若只含脾細(xì)胞 （⊕, ⊕-⊕, ⊕-⊕-⊕......），則在體外培養(yǎng)會(huì)漸漸死去。

3）   可能活下去的細(xì)胞 （⊕-⊙, ⊕-⊕-⊙, ⊙-⊙-⊕.....） 含有來自兩方的染色體，同源染色體可能發(fā)生基因重組，互換遺傳訊息；接下去的細(xì)胞分裂會(huì)排除多余的染色體，一直到只剩一組染色體時(shí)才告穩(wěn)定。在初期的分裂增殖過程中，失去含有重要基因染色體的子細(xì)胞可能會(huì)死去。成功穩(wěn)定的融合細(xì)胞株會(huì)經(jīng)由染色體的重組，得兼有雙方的特性： 即可分泌抗體，亦可在培養(yǎng)基HAT中生長(zhǎng)下去。

D）篩選方法：

1）   初步篩選： 融合后馬上以HAT培養(yǎng)，能活下來的都是上述B細(xì)胞與NS-1的正確融合細(xì)胞，但此時(shí)細(xì)胞的遺傳背景尚未穩(wěn)定。

2）   篩選專一性抗體： 并非所有B細(xì)胞都會(huì)產(chǎn)生我們所要的抗體，小白鼠原先就存在許多B細(xì)胞株以對(duì)抗一般疾病； 因此要用 酵素免疫分析法 （ELISA） 挑出專一性抗體 （請(qǐng)見下圖）。

3）   單株化： 這樣所挑出來的細(xì)胞株，也許仍含有兩群以上的細(xì)胞 （為什么？），因此要進(jìn)行單株化；先將該細(xì)胞株稀釋，重新平分到96槽細(xì)胞培養(yǎng)盤中，以計(jì)算使得每槽中只含有一個(gè)細(xì)胞，俟其生長(zhǎng)成群落后，再次以ELISA篩選專一性抗體。

E）抗體生產(chǎn)：

1）   可把挑選出來的融合細(xì)胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然后收集所產(chǎn)生的 腹水，腹水中的抗體濃度非常高，每mL可達(dá)數(shù)mg。 

2）   把融合細(xì)胞在大型培養(yǎng)槽中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液上清即得抗體，但每mL只得約數(shù) mg，濃度較腹水稀約一千倍。

3）   所得到的抗體再經(jīng)純化步驟，以除去雜質(zhì)，可用下列各種方法的組合︰

硫酸銨分劃： 收集約40% 飽和度的沉淀，是、方便的方法。     

離子交換法： 用DEAE陰離子交換法，多用在純化IgG。  

膠體過濾法： 以分子量的差異分劃出各種抗體，多用在純化IgM。

親和層析法： 以Protein A-吸著劑 專一性地吸住抗體分子 （IgG）。

當(dāng)單株抗體剛被發(fā)展出來時(shí)，人們因?yàn)樗裱策w彈般的準(zhǔn)確性，而對(duì)其應(yīng)用于癌癥的治療方面抱以*的希望；但是二十年來，并無突破性的進(jìn)展。主要的原因，并不是單株抗體無法攻擊癌細(xì)胞，或者是單株抗體的專一性不夠；原因之一乃是癌細(xì)胞的變化實(shí)在太大，無法找出各種癌細(xì)胞的共同抗原，以制成通用的抗癌單株抗體。雖然如此，單株抗體并沒有失去其科學(xué)上或醫(yī)療上的價(jià)值，它仍然是一個(gè)有用的工具，可以辨認(rèn)分子上細(xì)微的差異，而被應(yīng)用在很多其他方面；是目前的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)上，極重要且獲利率高的科技。