間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

試劑和材料：
1.*培養(yǎng)基：α-MEM：α-*基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含谷氨酰胺，無核苷酸或脫氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、經(jīng)F雜交瘤純化，非熱滅活、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml。過濾除菌。儲(chǔ)存于4℃，不超過2周；
2.A；
3.胰蛋白酶/EDTA；
4.聚丙烯離心管，15ml和50ml；
5.塑料組織培養(yǎng)皿，直徑15cm；
6.塑料微量移液器槍頭，10—1000μl；
7.0.85%臺(tái)盼藍(lán)鹽溶液；
8.微量移液器；
9.改良的Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)器

實(shí)驗(yàn)方法：
1.在培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞中小的、貼壁、紡錘形的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞匯合至60%時(shí)，對(duì)其進(jìn)行處理。如果單層細(xì)胞稀疏，則進(jìn)行繼續(xù)潤洗和更換培養(yǎng)基；
2.按如下步驟消化單層細(xì)胞；
（1）用20ml預(yù)熱的A潤洗單層細(xì)胞后，加入5ml胰蛋白酶/EDTA；
（2）將培養(yǎng)皿置于37℃ 2min，在10&time放大倍數(shù)視野下觀察單層細(xì)胞。貼壁細(xì)胞應(yīng)正從塑料瓶上脫落；
（3）將培養(yǎng)皿置于37℃ 2min，再次觀察。重復(fù)觀察直至90%的MSCs已從培養(yǎng)瓶中脫落下來；
（4）加入5mlCCM，將10ml懸液移至15ml離心管中，500g離心10min；
（5）離心完畢，棄去上清，每管用1—2ml預(yù)熱的A重懸沉淀。如有必要，混合多管細(xì)胞懸液只進(jìn)行一次細(xì)胞計(jì)數(shù)；
3.取10μl細(xì)胞懸液加到10μl臺(tái)盼藍(lán)中，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。合適的細(xì)胞懸液濃度為（2—5）&time10⁵個(gè)細(xì)胞/ml，存活率需高于80%。胰蛋白酶消化后用于傳代的早期培養(yǎng)物懸液，亦可進(jìn)行集落形成單位（CFU）測定、凍存或分化測定；
4.將細(xì)胞以50—100個(gè)細(xì)胞/cm的密度接種到培養(yǎng)皿中，保持低密度以保證快速的自我更新和多潛能特性。用預(yù)熱CMM以7&time10³（zui終濃度為50個(gè)細(xì)胞/cm2）到1&time10⁴（zui終濃度為100個(gè)細(xì)胞/cm²）的密度重懸MSCs；
5.預(yù)備適當(dāng)數(shù)量的15cm培養(yǎng)皿，加入25ml預(yù)熱的CMM；
6.接種1ml步驟2和3所得的細(xì)胞懸液。來回滑動(dòng)平皿（勿打圈）使細(xì)胞分布均勻。培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中，標(biāo)記為一代細(xì)胞；
7.培養(yǎng)2—3天后，觀察并評(píng)價(jià)形態(tài)。MSCs應(yīng)為小的、紡錘體形狀，頻繁折光的雙聯(lián)體。此為培養(yǎng)良好的MSCs；
8.從培養(yǎng)皿中吸出培養(yǎng)基，用20ml預(yù)熱的A潤洗，加入25ml預(yù)熱的新鮮CMM；
9.每次傳代時(shí)所需的培養(yǎng)皿數(shù)量取決于可以接種的細(xì)胞數(shù)量。方案中的上述體積適用于MSCs接種單個(gè)15cm培養(yǎng)皿。如有需要可按此例擴(kuò)大以接種多個(gè)培養(yǎng)皿；