實(shí)驗(yàn)試劑

氯仿[重慶川東化工集團(tuán)有限公司]

異丙醇[重慶川東化工集團(tuán)有限公司]

無(wú)水乙醇[重慶川東化工集團(tuán)有限公司]

異戊醇[上?；瘜W(xué)試劑有限公司]

溴酚藍(lán)[上海三愛(ài)思試劑有限公司]

二甲苯氰FF[Amersco Co.]

溴化乙錠[Amersco Co.]

飽和酚(pH 7.0 )[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

Taq DNA聚合酶[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

十二烷基肌氨酸鈉[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

十二烷基硫酸鈉[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

三輕甲基氨基甲烷[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

乙二氨四乙酸[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

飽和酚[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

100 bp Ladder DNA Marker [ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

瓊脂糖[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

SW-CJ-CO凈化工作臺(tái)[蘇州凈化設(shè)備有限公司]

FA1004A型電子天平[上海精天電子儀器廠]

70型離子純水器[上海亞榮生化儀器廠]

SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器[無(wú)錫科達(dá)儀器廠]

Mikro22R型高速冰凍離心機(jī)[Whatman Biometra]

5415D臺(tái)式離心機(jī)[Eppendorf]

SS-325型高壓滅菌器[Tomy Kogyo Co. Ltd]

YLE-2000數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋[上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠]

pHS-4C型酸度計(jì)[成都方舟科技開(kāi)發(fā)公司]

2002型振蕩器[常州國(guó)華電器有限公司]

旋渦混合器[北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司]

梯度熱循環(huán)儀[Whatman biometra]

凝膠成像系統(tǒng)[上海四星生物技術(shù)實(shí)業(yè)有限公司]

MDF-382E型超低溫保存箱[Sanyo Electric Biomedical Co., Ltd]

DYY 12型電腦三恒多用電泳儀[北京六一儀器廠]

SmartSpec^TM3000核酸濃度分析儀[BIO-RAD]

實(shí)驗(yàn)材料

三色書虱采自野外，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)建立種群。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 三色書虱總DNA的制備

   (1) 將50頭書虱置于1.5mL的離心管中，用研棒在液氮環(huán)境中迅速將試蟲(chóng)充分研碎后加入200μL DNA提取裂解液。

   (2) 加入2.5μL蛋白酶K溶液(20 mg/mL)，50℃水浴2h(或培養(yǎng)過(guò))。

   (3) 用等體積的平衡酚( Tris-HC1飽和酚，pH7.8 )，溫和振蕩搖勻(約20 min )，置20℃下保存5-10 min。

   (4) 4℃下離心l0min，將粘稠的水相移至潔凈的離心管中。

   (5) 用等體積的酚:氯仿(1:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿各抽提取一次，離心(9000 r/min 10 min)取上清液。

   (6) 加入0.2倍體積的乙酸鈉溶液(10 mol/L)和兩倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃放置2h使DNA充分沉淀。

   (7) 離心(12000 r/min 10 min )，棄上清液，沉淀用70%乙醇(4℃)洗滌兩次。

   (8) 沉淀晾干(盡可能除去乙醇)后，將DNA重懸浮于TE緩沖液(pH8.0 )，于37℃中輕輕搖動(dòng)有利于DNA重懸浮，使DNA充分溶解。

   (9) 加入Rnase至終濃度為lμg/mL，37℃保溫lhr。

   (10) 按(4)~(9)抽提，沉淀，重懸DNA，在1μL雙蒸滅菌水或TE中，4℃保存。

   (11) 取DNA4μL與2μ1 6x加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣到1.4%瓊脂糖凝膠中，以2.5-5 v/cm電泳。

   (12)  0.5μg/mL的EB染色15-30min，紫外燈下觀察拍照。

制備的DNA濃度用SmartSpec^TM3000核酸濃度分析儀檢測(cè)，要求先將比色杯用100μL/次的無(wú)菌水反復(fù)清洗再測(cè)水的吸光度，之后將DNA液稀釋50倍進(jìn)行檢測(cè)。要求OD=1.7左右。

2. 三色書虱體內(nèi)共生細(xì)菌Wolbachia的Long PCR檢測(cè)

Long PCR的20uL的反應(yīng)體系包括:

wsp-F, 5'-TGG TCC AAT AAG TGA TGA AAG AAA CTA GCT A

wsp-R, 5'-AAAAAT TAAACG CTA CTC CAG CTT CTG CAC

用無(wú)菌水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至20μL

擴(kuò)增條件為：94 ℃ 2min預(yù)變性后，94℃ l0sec，65℃ 30sec，68℃ lmin，10個(gè)循環(huán)；94℃ l0sec，65℃ 30sec，68℃ lmin。25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在68℃下延長(zhǎng)20sec。

擴(kuò)增結(jié)束后取5μL的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(電壓5v/cm，電泳緩沖液為1 X TAE )，Bio-Rad凝膠成象系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

3. 序列的測(cè)定和分析

Wolbachia wsp基因序列由Long PCR產(chǎn)物上海生工直接測(cè)序獲得。DNA序列檢索和同源性比較利用BLAST工具(NCBI)。用程序中的zui大似然法(Maximum Likelihood method，ML)重建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)中結(jié)點(diǎn)的自舉檢驗(yàn)置信度以1000次重復(fù)計(jì)算估計(jì)。對(duì)獲得的三色書虱體內(nèi)Wolbachia的wsp基因的片段進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，其它一些宿主體內(nèi)的Wolbachia的wsp基因的片段則通過(guò)GenBank獲得。