實(shí)驗(yàn)試劑

1. 75%酒精

2. 5% FCS-RPMI-1640*培養(yǎng)液與RPMI-1640*培養(yǎng)液

3. ConA或PHA

4. IL-1標(biāo)準(zhǔn)品：倍比稀釋成至少6個(gè)不同濃度值。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1. ³H-TdR、β-液閃汁數(shù)儀，微量細(xì)胞收集儀

2. 解剖刀、剪、單皿、研磨工具(玻璃勻漿器，不誘鋼網(wǎng)或者毛玻璃片，用于研磨小鼠胸腺)

3. 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板

4. 刻度吸管，毛細(xì)吸管，刻度離心管、離心機(jī)、細(xì)胞計(jì)數(shù)板，倒置顯微鏡，加樣器(頭)，50%CO₂培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)

實(shí)驗(yàn)材料

1. 小鼠：BALB/C或C57BL/6小鼠，6-10周齡，雌雄均可。

2. IL-1待測(cè)樣品：倍比稀釋成至少6個(gè)不同濃度值。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 準(zhǔn)備工作與ConA或PHA亞適劑量的確定

測(cè)定樣品前必須作ConA或PHA的劑量曲線(xiàn)，觀察其對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞增殖的影響，選擇一個(gè)既能夠激活胸腺細(xì)胞，但又不引起其明顯增殖的合適劑量，即亞適劑量。

   1) 在96孔培養(yǎng)板各孔中加入小鼠胸腺細(xì)胞，100μl/孔；

   2) 加入不同濃度的ConA(或PHA)，100μl/孔，使其終濃度分別為0.5μg/ml，1μg/ml ，2μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，各設(shè)三復(fù)孔，以不加ConA的培養(yǎng)液作對(duì)照；

   3) 置37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，收獲前12h加入³H-TdR，0.5μci/50μl/孔；

   4) 用微量細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞于玻璃纖維紙上，用β-液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定各孔cpm值；數(shù)據(jù)(cpm)以三個(gè)復(fù)孔平均值 標(biāo)準(zhǔn)差表示，

   5) 數(shù)據(jù)(cpm)以三個(gè)復(fù)孔平均值 標(biāo)準(zhǔn)差表示，繪制ConA劑量曲線(xiàn)，據(jù)此選擇亞適劑量，通常為0.2-2.0μg/ml)(終濃度)；

2. 操作步驟

   1) 拉頸處死小鼠，浸泡于75%酒精中3-5min，消毒處理；

   2) 無(wú)菌操作取出小鼠胸腺，放入含有RPMI-1640*培養(yǎng)液的平皿中；

   3) 將胸腺剪碎(或研磨工具磨碎)，無(wú)菌紗布過(guò)濾，制成單個(gè)胸腺細(xì)胞懸液；

   4) 用PRMI-1640*培養(yǎng)液洗滌上述細(xì)胞2次，1500r/min離心10min，然后用5% FCS-RPMI-1640*培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為1.5×10⁷/ml；

   5) 在96孔培養(yǎng)板各孔中加入小鼠胸腺細(xì)胞，100μl/孔；

   6) 將倍比稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品加到上述各孔中，100μl/孔，一式3份，設(shè)培養(yǎng)液對(duì)照及有絲分裂原對(duì)照。

   7) 將預(yù)先確定的亞適劑量的ConA(終濃度約0.2~2.0μg/ml)或PHA(終濃度為約0.5~4.0μg/ml)加入96孔培養(yǎng)板中，100μl/孔。

   8) 置37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，收集*-12h加入³H-TdR 0.5uci/50ul/孔。

   9) 用微量細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞于玻璃纖維紙上，用β液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定各孔³H-TdR摻入量(cpm值)。

注意事項(xiàng)

1. 所制備的小鼠胸腺細(xì)胞存活率應(yīng)>95%。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品應(yīng)以1:2開(kāi)始至少6個(gè)倍比稀釋度。

3. 加樣時(shí)，應(yīng)以低濃度到高濃度順序加入，且不可共用加樣器頭。

4. 由于受其他細(xì)胞因子的影響，本法特異性受到一定限制。

5. 亦可用D10G4.1細(xì)胞(小鼠T輔助細(xì)胞克隆)代替上述小鼠胸腺細(xì)胞進(jìn)行IL-1生物活性檢測(cè)，基本方法相同。但由于D10G4.1細(xì)胞對(duì)IL-1的敏感性大大增強(qiáng)，而對(duì)IL-2相對(duì)不敏感，且對(duì)IL-1的敏感性比對(duì)IL-2的敏感性大100~1000倍，故本法敏感性與特異性均較小鼠胸腺細(xì)胞增殖法。