第九章 蛋白顯色

    酶促反應(yīng)比同位素安全且快速，已經(jīng)成為 Western Blot 的主流檢測方法。酶促反應(yīng)可以搭配不同的底物從而實現(xiàn)不同的顯色方法：化學(xué)發(fā)光和底物顯色，前者靈敏度很高，已經(jīng)達到皮克級別，甚至還有飛克級別的，靈敏度超過了同位素；而后者由于直接顯色而操作簡便且成本低。

    大家zui為熟悉熟悉當數(shù)辣根過氧化物酶 HRP（Horseradish Peroxidase）和堿性磷酸酶 AP（AlkalinePhosphatase），此外還有比較少見的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）和 β 半乳糖苷酶（β-Galactosidase）。在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。堿性磷酸酶可以將無色的底物 5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）轉(zhuǎn)化為藍色的產(chǎn)物；而辣根過氧化物酶可以以H2O2為底物，將 3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產(chǎn)物或?qū)?/span> 4-氯萘酚氧化成藍色產(chǎn)物。另一種檢測辣根過氧化物酶的方法是用增強化學(xué)發(fā)光法，辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾（luminol，氨基苯二酰一肼）并發(fā)光，在化學(xué)增強劑存在下光強度可以增大 1000 倍，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測辣根過氧化物酶的存在。

① HRP 標記二抗用 DAB 顯色，按順序依次將 DAB 三種劑各取 3 滴于 5 ml 蒸餾水中，避光混勻，將膜加入顯色液中避光顯色 5-15min 終止反應(yīng)，對照 Marker 記錄實驗結(jié)果，將 NC 膜晾干掃描保存。HRP的生色底物顯色有 DAB、4-CN、CN/DAB、AEC 和 TMB 等。

     HRP 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)底物主要有 Luminol、ECL 和 SuperSignal 系列?？芍苯訌墓举徺I試劑盒，操作比較簡單，原理如下（二抗用 HRP 標記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到 HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。

② AP顯色底物生成的產(chǎn)物主要是藍紫色，成像性好容易拍照。 AP的底物顯然更穩(wěn)定，不像HRP那樣需要新鮮 配制 的 H2O2一 類 的不穩(wěn) 定成 分，作 為試 劑盒可 以保 存時間 更長 。常用顯 色底物 的是BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3 ’ -Indolyphosphate p-Toluidine Salt) ， NBT (Nitro-Blue TetrazoliumChloride)和INT。

③ 底物發(fā)光法：將兩種顯色底物 1:1 等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻璃膠片把膜包起來，馬上在暗室中將 X 光片覆蓋在膜的上面（時間根據(jù)光的亮度來衡量），顯影、定影。（注意：發(fā)光法檢測的時候曝光時間要恰到好處，過短會導(dǎo)致曝光不*，影響條帶亮度，過長會導(dǎo)致熒光信號衰弱，也會使背景顏色加深）除了酶連二抗作為指示劑，也可以使用其它指示劑，比如：熒光素異硫氰酸鹽標記的二抗（可通過紫外燈產(chǎn)生熒光）；生物素結(jié)合的二抗等等。

關(guān)于磷酸化蛋白檢測的注意事項：

① 保持待測蛋白處于磷酸化狀態(tài)，在標本提取液中加入足夠的磷酸酶抑制劑（NaF，可以防止去磷酸化），并將標本時刻保持在冰浴中。

② 使用 5%的 BSA 作為封閉試劑，不能使用脫脂奶粉（因為脫脂奶粉中含有酪蛋白，會出現(xiàn)很高的背景）。

③ 請謹記蛋白的磷酸化是需要誘導(dǎo)的，當信號低或者無信號時有可能是磷酸化誘導(dǎo)不充分！確保使用陽性對照。