羊副結(jié)核病抗體(M.ptAb)ELISA試劑盒操作原理

本試劑盒僅供研究使用。

實驗原理

羊副結(jié)核病抗體(M.ptAb)ELISA試劑盒應(yīng)用雙抗原夾心法測定標本中羊副結(jié)核病抗體（M.ptAb）表達。用純化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，可與樣品中副結(jié)核病抗體（M.ptAb）相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與HRP標記的抗原結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標抗原復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標本中羊副結(jié)核病抗體（M.ptAb）的存在與否。

羊副結(jié)核病抗體(M.ptAb)ELISA試劑盒組成

1、30倍濃縮洗滌液20ml×1瓶7終止液6ml×1瓶

2、酶標試劑6ml×1瓶8陽性對照0.5ml×1瓶

3、酶標包被板12孔×8條9陰性對照0.5ml×1瓶

4、樣品稀釋液6ml×1瓶10說明書1份

5、顯色劑A液6ml×1瓶11封板膜2張

6、顯色劑B液6ml×1/瓶12密封袋1個

標本要求

1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

羊副結(jié)核病抗體(M.ptAb)ELISA試劑盒操作步驟

1.編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每板應(yīng)設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）

2.加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7.溫育：操作同3。

8.洗滌：操作同5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00;陰性對照平均值≤0.10

臨界值（CUTOFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

陰性判定：樣品OD值<臨界值（CUTOFF）者為羊副結(jié)核病抗體（M.ptAb）陰性

陽性判定：樣品OD值≥臨界值（CUTOFF）者為羊副結(jié)核病抗體（M.ptAb）陽性。

羊副結(jié)核病抗體(M.ptAb)ELISA試劑盒注意事項

1．操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。

2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

3．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

4．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5．底物請避光保存。

6．試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準，使用雙波長檢測時，參考波長為630nm

7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時必須注意安全。

羊副結(jié)核病抗體(M.ptAb)ELISA試劑盒保存條件及有效期

1．試劑盒保存：2-8℃。

2．有效期：6個月