實(shí)驗(yàn)試劑

HBSS： 
NaCl 8g/L
KCl 400mg/L
KH₂PO₄ 60mg/L
無(wú)水Na₂PO₄ 47.86mg/L
無(wú)水葡萄糖 1000mg/L
NaHCO₃ 350mg/L

實(shí)驗(yàn)材料

妊娠期BALB/c小鼠

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 將1~2天齡新生裸鼠窒息后，置于培養(yǎng)皿中，用1%碘聚乙烯吡咯烷酮液洗凈裸鼠，流水*沖洗，然后用70%乙醇洗兩次。小鼠應(yīng)立即使用，若待處理的小鼠數(shù)量較多，可置冰上30min。
2. 去除小鼠的四肢和尾巴。
3. 將小鼠從尾巴至鼻子的皮膚作一簡(jiǎn)單切口，用大鼠牙齒鑷輕輕將整個(gè)身體的皮膚剝下，用一把鑷子夾住身體，另一把鑷子拉開(kāi)皮膚。
4. 將剝下的皮膚組織置于放在冰上的無(wú)菌培養(yǎng)皿表面，直至所有的皮膚收集完畢。
5. 用2把大鼠牙齒鉗夾住皮膚組織，在含2.5%胰蛋白酶的HBSS無(wú)菌培養(yǎng)皿中漂洗皮膚組織（組織在下），然后置4^oC過(guò)。表皮不應(yīng)淹沒(méi)在胰蛋白酶液中。
6. 從胰蛋白酶處理液中取出組織，將表皮面朝下置于干燥的無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿表面。表皮易于貼附于塑料上，組織用組織鉗扯去，鼠齡與此有影響，天齡越大，去其表皮越困難。
7. 用剪刀小心地將表皮殘留物剪碎，置于含“常規(guī)”培養(yǎng)液（MEM含10%FCS，100IU/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素，2~4mmol/L L-谷氨酰胺；每5只小鼠皮膚用10ml）的無(wú)菌燒瓶中，磁力攪拌器37^oC劇烈攪拌45min。
8. 用4層無(wú)菌Nitex紗布（16um孔，Martin提供）過(guò)濾液體。當(dāng)其他細(xì)胞通過(guò)時(shí)角質(zhì)層細(xì)胞留在紗布的表面。
9. 用培養(yǎng)瓶將細(xì)胞洗下，培養(yǎng)基的用量約為一塊皮膚10ml，將細(xì)胞接種于塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶中或玻璃蓋玻片上，37^oC培養(yǎng)4~12h。
10. 4~12h后觀察培養(yǎng)皿表面的細(xì)胞群。
11. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至低鈣培養(yǎng)液，角質(zhì)細(xì)胞將開(kāi)始繁殖。這種轉(zhuǎn)移防止細(xì)胞的分層。低鈣液由MEM（無(wú)鈣）和10%螯合的FCS（同樣含有正常水平的青霉素、鏈霉素）組成。螯合的血清按下法準(zhǔn)備：每50ml血清需20g樹(shù)脂，Chelex 100（Bio-Rad）。將樹(shù)脂置于水中，40g/L，pH約為7.4，放置濾紙于漏斗上，過(guò)濾樹(shù)脂。加入樹(shù)脂于FCS中，攪拌60min。接著過(guò)濾使血清變得清亮，再用0.45ug濾紙除菌。后者過(guò)濾過(guò)程較慢。需用購(gòu)買的商品化濾器。*培養(yǎng)液中鈣離子濃度約為0.09mmol/L，與0.15mmol/L鈣濃度相比這是普通培養(yǎng)液。

注意事項(xiàng)

小鼠角質(zhì)細(xì)胞在低鈣中維持至1周時(shí)間，盡管細(xì)胞活力有所降低?？赏ㄟ^(guò)商業(yè)途徑如Clonetics和GIBCO/BRL獲得書中低鈣、無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)角質(zhì)細(xì)胞。膠質(zhì)細(xì)胞在這種培養(yǎng)液中能保存較長(zhǎng)時(shí)間，并在多數(shù)情況下進(jìn)行幾次分裂。為了誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞分層，應(yīng)向細(xì)胞中加入正常水平的鈣。
使用一次性塑料組織培養(yǎng)器材，而不是玻璃器材。若確需使用玻璃器材，應(yīng)用酸浸泡后再行高壓滅菌。需要使用的器材還有大叔牙齒鉗、尖解剖剪、活組織吸取器。上述器材應(yīng)高壓滅菌或在95%乙醇中浸泡、燒灼。