一、勻漿介質(zhì)
一般采用0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶可根據(jù)樣本及測(cè)定指標(biāo)的情況自行設(shè)定濃度,目的是保持樣本的等滲環(huán)境。
二、細(xì)胞樣本的前處理:
1、細(xì)胞沉淀的收集：
① 懸浮細(xì)胞: 對(duì)于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，直接通過(guò)離心收集細(xì)胞沉淀，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘，棄上清留細(xì)胞沉淀。
② 貼壁細(xì)胞: 對(duì)于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，用胰酶將細(xì)胞消化下來(lái)，或用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下來(lái)，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘，棄上清留細(xì)胞沉淀。
我們一般建議客戶，細(xì)胞密度不要小于一百萬(wàn)個(gè)/ml。
2、細(xì)胞沉淀的洗滌：
在細(xì)胞沉淀中加入0.5-1ml的PBS （等滲）， 輕輕顛倒混勻，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘，棄上清留細(xì)胞沉淀。
重復(fù)上述操作反復(fù)洗滌1～2次。
3、勻漿的方式：手工勻漿，超聲破碎,裂解液裂解,反復(fù)凍融。
① 手工勻漿：在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據(jù)所測(cè)指標(biāo)的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細(xì)胞密度不小于一百萬(wàn)個(gè)/ml），混勻，將細(xì)胞懸浮于PBS中，用移液器將細(xì)胞懸浮液移至玻璃勻漿管中（2ml玻璃勻漿管），將玻璃勻漿管置于冰水混合物中，手動(dòng)勻漿3分鐘，然后取破碎好的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行測(cè)定。
② 超聲破碎:
在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據(jù)所測(cè)指標(biāo)的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細(xì)胞密度不小于一百萬(wàn)個(gè)/ml），混勻，將細(xì)胞懸浮于PBS中，在冰水浴條件下進(jìn)行如下操作:
a、用超聲粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細(xì)胞破碎，也可用國(guó)產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用400安培，5秒/次，間隙10秒反復(fù)3～5次。
b、用超聲細(xì)胞破碎儀，300W功率，每次超聲3～5秒，間隔30秒，重復(fù)4～5次。
③ 裂解液裂解
常用裂解液有SDS、NP-40、TritonX-100,這三種去垢劑的作用是不同的，或者說(shuō)作用力量強(qiáng)弱不同。
1、SDS屬于離子型去垢劑，zui厲害，基本可以把細(xì)胞*破掉，DNA會(huì)釋放出來(lái)，裂解液變得很粘稠。
2、NP-40是很溫和的去垢劑，1%濃度的基本可以破壞掉胞膜，而對(duì)核膜破壞的作用弱，結(jié)合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。
3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間，偏向于NP40，也是常用的細(xì)胞裂解液成分之一，在保護(hù)蛋白活性方面有一定作用（SDS基本會(huì)使蛋白變性失活）。
去垢劑屬性只是一方面，buffer、配比、濃度、提取方法和材料處理也都是關(guān)鍵因素由于很多裂解液都是蛋白變性劑,對(duì)酶活力的測(cè)定有一定的影響,一般不推薦用裂解液進(jìn)行裂解。
④ 反復(fù)凍融:
在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據(jù)所測(cè)指標(biāo)的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細(xì)胞密度不小于一百萬(wàn)個(gè)/ml），混勻，將細(xì)胞懸浮于PBS中，放低溫冰箱中結(jié)冰，溶解，再結(jié)冰，再溶解，反復(fù)3次左右）。
由于反復(fù)凍融對(duì)酶活力影響較大,一般不推薦使用