導(dǎo)讀：普通農(nóng)夫的谷倉里肯定沒有款的HiSeq測序系統(tǒng)。不過，這并不意味著新一代測序(NGS)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域就不如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域那么重要。

　　喬治亞大學(xué)的特聘教授Andrew Paterson就利用NGS來捕獲群體的多樣性，他將基因型與參考基因組進(jìn)行比較。他領(lǐng)導(dǎo)的植物基因組作圖實驗室也利用NGS從不同個體中獲得許許多多的許可，“這樣我們可以了解誰和誰關(guān)系比較近”。

　　不管是研究玉米，還是研究小鼠，傳統(tǒng)的遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和生物化學(xué)、生物信息學(xué)以及其他學(xué)科中的許多技術(shù)都是一樣的。然而，植物為研究人員帶來了一些*的挑戰(zhàn)和機(jī)遇。

　　多倍體

　　植物可能攜帶了基因組的多個拷貝，比如說，面包小麥?zhǔn)橇扼w，而甘蔗的拷貝數(shù)多達(dá)200個。“即使是四倍體，我們都很少有高質(zhì)量的參考序列，更不用說六倍體了，”HudsonAlpha生物技術(shù)研究所的Jeremy Schmutz談道。誠然，亞基因組之間有足夠的差異，讓你將大多數(shù)基因與每條染色體的不同特點相關(guān)聯(lián)，但并非全部。Schmutz說，有很多東西，你無法說出它們從哪里來，到哪里去，因為有太多的拷貝。甘蔗就更不用說了。

　　通常情況下，人們對親本或祖先種或者模式生物開展遺傳學(xué)和基因組學(xué)分析。短柄草(Brachypodium)的基因組就特別小;它常作為小麥或其他草類的替身。“重測序小麥可能需要Illumina HiSeq X Ten的半個流動槽，這相當(dāng)于5個人類基因組。而短柄草只有350 Mb，因此你可以盡情測序，”Schmutz說。你可以誘導(dǎo)突變，測定表型，如果你發(fā)現(xiàn)了一些有趣的，可以看看小麥中的相同基因做了什么。

　　參考呢

　　目前zui的植物基因組是水稻基因組，這主要是因為“我們使用了非常非常小心的BAC-by-BAC方法。我們利用Sanger測序?qū)γ總€BAC(細(xì)菌人工染色體)進(jìn)行單獨測序，”亞利桑那基因組研究所的Rod Wing教授談道。這個基因組于2005年發(fā)表。

　　Wing還參與了玉米基因組的測序，這也是通過BAC-by-BAC開展的。不過那時，“我們沒有足夠的資金來完成每個BAC，因此*完成的是真正的基因部分，”Wing解釋道。zui近，人們利用短讀取技術(shù)測序了基因組，產(chǎn)生了缺乏大部分非編碼區(qū)域的基因組組裝。

　　NGS的zui大問題之一是短讀取無法很好地對付重復(fù)片段，這可能占了基因組的一半?，F(xiàn)在有一種技術(shù)能夠很好地應(yīng)對，南伊利諾伊大學(xué)的David Lightfoot教授談道，那就是PacBio的長讀取技術(shù)，它往往能夠跨過重復(fù)區(qū)域。Lightfoot的研究團(tuán)隊正準(zhǔn)備發(fā)表橄欖樹基因組，這就是結(jié)合短讀取和長讀取測序的。

　　高分子量DNA

　　BAC、長讀取測序、mate­pair文庫構(gòu)建，以及其他一些方法，都需要相對高分子量的DNA。“對于血液樣本而言，這很容易獲得，但是對植物來說有點難，因為它們積累了碳水化合物以及其他的代謝產(chǎn)物，可能降解DNA，”Schmutz說。此外，葉綠體可能貢獻(xiàn)了10% 的DNA。去除它們，“這樣你就不會一而再、再而三地把錢浪費在葉綠體的重測序上，”Lightfoot說。他使用了各種方法，包括在黑暗中育苗(這也能去除淀粉)，從根部取樣，或者使用現(xiàn)成的試劑盒來分離細(xì)胞核。

　　Wing的團(tuán)隊不依賴試劑盒，而是裂解并離心細(xì)胞，然后用溫和的去污劑(如Triton™ X­100)重懸沉淀，裂解葉綠體和線粒體，但保持細(xì)胞核完整。“然后你就可以取出細(xì)胞核，純化出高分子量的DNA，用于PacBio或長讀取測序，”他說。為了制備BAC文庫，他的團(tuán)隊將DNA嵌入低熔點瓊脂糖中，創(chuàng)造出DNA多孔袋，讓純化DNA的酶和試劑可在其中擴(kuò)散。DNA則永遠(yuǎn)不會受到任何剪切力。

　　新應(yīng)用

　　目前，植物基因組學(xué)中的大部分經(jīng)費都用來生成參考基因組。下一步是尋找作物的多樣性，并查看它們的野生親緣種。“在馴化過程中，你可能經(jīng)歷了消除所有變異的過程，不過事實證明，這種變異有望解決許多的農(nóng)業(yè)問題，”Wing說。密歇根州立大學(xué)的Rebecca Grumet教授及其團(tuán)隊正在尋找葫蘆科的抗病遺傳標(biāo)記(QTL)，特別是西瓜、甜瓜、黃瓜和南瓜，這zui終將幫助育種者輕松篩查抗病品種。遺傳標(biāo)記能幫助育種者混合多個性狀，抵抗多種疾病，還能帶來其他的優(yōu)良性狀。

　　她的團(tuán)隊是利用兩種測序法基因分型(GBS)來實現(xiàn)的。*種是基于雙親交配：將抗病株與敏感株雜交，查看后代。它們都有全基因組參考序列，因此能夠找出性狀所在的位置。第二種是GWAS：他們計劃對每種作物的1000個種質(zhì)資源進(jìn)行測序，特別是它起源的區(qū)域。他們將利用這些信息來了解多少遺傳多樣性是來自那里，并建立核心種質(zhì)。

　　此外，許多其他的NGS技術(shù)，比如RNA­Seq，也將在植物學(xué)研究中大顯身手。如今測序已經(jīng)扎下了根，而隨著成本繼續(xù)下降，新一代的研究人員更加熟練，它的應(yīng)用必將開花結(jié)果。

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