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構(gòu)建高產(chǎn)細胞株的基本步驟

來源:上海通蔚實業(yè)有限公司   2016年06月12日 09:26  

    導讀:構(gòu)建高產(chǎn)細胞株的基本步驟為轉(zhuǎn)染-篩選-擴增-單克隆化-篩選-馴化。
   首先,通過質(zhì)粒將目的蛋白的編碼基因?qū)氲郊毎麅?nèi)。質(zhì)粒上除了目的基因外還帶有抗性基因,比如抗生素抗性基因。這樣在轉(zhuǎn)染后就可以利用選擇壓力富集整合質(zhì)粒的細胞。在哺乳動物細胞中質(zhì)粒不能進行復制,未整合到基因組中的質(zhì)粒隨著細胞分裂逐漸丟失。在一段時間的選擇壓力后,所有存活下來的細胞基因組中都整合了外源質(zhì)粒。
   
獲得了一系列整合了外源基因的穩(wěn)定細胞后,接下來就需要從中篩選出表達量zui高的克隆。zui常用的方法是檢測96孔細胞培養(yǎng)板中蛋白的濃度;另外一個方法是讓細胞在軟瓊脂上生長形成集落,然后利用原位免疫沉淀技術獲得高產(chǎn)細胞。近年來,發(fā)展起來的高通量自動化篩選技術也被受關注。
   
為實現(xiàn)克隆的高表達,在有些情況下外源基因擴增,比如以CHO用作宿主細胞;有些情況則不需要,比如雜交瘤細胞。為了實現(xiàn)外源基因的擴增,將細胞在高濃度的擴增標記(比如dhfr)抑制劑的壓力下生長。細胞存活需要擴增標記。高濃度的抑制劑能夠殺死除擁有多個擴增標記基因以外的絕大多數(shù)細胞。在標記基因擴增的過程中,與它相鄰的基因也隨之發(fā)生擴增?;蚩截悢?shù)的增加導致轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的提高。在這個過程中,某些高產(chǎn)細胞株重組IgG重鏈的轉(zhuǎn)錄水平成為細胞內(nèi)zui高。另一方面,過高的蛋白表達可能會超過細胞內(nèi)蛋白折疊的限度,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生未折疊蛋白效應導致細胞凋亡。因此沒有建立起與高表達相匹配的其它結(jié)構(gòu)的細胞可能不能存活。
     
基因擴增后的細胞既含有多個拷貝的外源基因,能高水平的表達目的基因和抗性基因,還具備了強大的蛋白分泌能力。除此之外,高產(chǎn)細胞株還應具備高密度培養(yǎng)和能維持較長平臺期的能力。
    
基因擴增后的細胞可以視為一個細胞“Pool”,其中含有眾多不同遺傳背景的細胞,或是基因插入位點的不同,或是擴增程度的不同等等。因此基因擴增后下一步是細胞的單克隆化。單克隆化是利用流式細胞儀或有限稀釋法或其他自動化方式(0.2個細胞/孔)將細胞接種到多孔板中??梢哉J為從某一特定孔里長出的細胞都是由早期的一個細胞分裂而來,他們在遺傳上是同源的。
     
單克隆化后需要對獲得的細胞株進行初步的評價。主要包括生長特性,產(chǎn)品質(zhì)量的評價。有些情況下需要將細胞馴化到更接近生產(chǎn)模式的條件下,進行培養(yǎng)。
     
單克隆化細胞株構(gòu)建過程中的關機環(huán)節(jié)。通常不管是否進行基因擴增都應進行細胞的單克隆化。盡管用于構(gòu)建細胞株的宿主細胞都是非整倍體,傾向于進行基因組重排和表觀遺傳學的改變;但是單克隆化獲得的細胞在同源性上遠高于細胞“Pool”。從單個細胞開始到生產(chǎn)環(huán)節(jié)結(jié)束,細胞大概需要進行60次分裂;如果算上整個產(chǎn)品的市場壽命,細胞至少需要80次分裂。通過單克隆化可以防止zui初細胞“Pool”里發(fā)生突變或產(chǎn)量低細胞成為優(yōu)勢群體,逐漸取代高產(chǎn)細胞,導致細胞不穩(wěn)定。

 

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