氨基酸分析是生命科學(xué)研究中最重要的技術(shù)之一。氨基酸是人體蛋白質(zhì)的基本組成物質(zhì)，除個別芳香族氨基酸外，紫外吸收均較弱，直接使用紫外檢測器檢測靈敏度低。故氨基酸分析通常需要選擇合適的衍生試劑增加氨基酸的生色團，再使用紫外檢測器進行檢測。目前氨基酸衍生主要包括柱前和柱后衍生兩種方法。
游離氨基酸的測定方法主要有柱前衍生反相色譜法、柱后衍生離子交換色譜法、離子色譜-積分脈沖安培檢測法、液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法、柱前衍生氣相色譜法、衍生化毛細管電泳法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、超臨界流體色譜法等，其中柱前衍生反相色譜法和柱后衍生離子交換色譜法為藥品中氨基酸測定常用方法。
艾杰爾公司于2024年12月17日新推出的 Durashell AA 氨基酸分析方法是基于目前廣泛使用的以 OPA（鄰苯二醛）和 FMOC（9- 芴基甲基氯甲酸鹽）為衍生劑的柱前衍生 HPLC 氨基酸分析方法。該方法具有簡便、快速、準確、無需要手工衍生，可全自動化在線分析、衍生試劑無毒等優(yōu)點，通過液相進樣器自動衍生程序的設(shè)置，大大減少研究人員在衍生過程中的操作步驟及誤差。
圖 1. OPA 在巰基試劑存在下與一級氨基酸的衍生反應(yīng)圖
圖 2. FMOC 與二級氨基酸的衍生反應(yīng)圖
同時，氨基酸分析也常用于測定蛋白質(zhì)、多肽及其他藥物制劑中氨基酸組成或含量。多肽作為由多個氨基酸通過肽鍵連接而形成的一類化合物，通常由 10~100 個氨基酸分子組成，連接方式與蛋白質(zhì)相同，相對分子質(zhì)量一般低于 10000。根據(jù) 2023 年 CDE 發(fā)布的《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，在合成多肽原料藥的質(zhì)控考察項目中，氨基酸分析數(shù)據(jù)可用于計算多肽藥物的氨基酸比值。氨基酸分析的水解方法可參考相關(guān)技術(shù)指南進行（例如《中華人民共和國藥典》（2020 年版）第一增補本（四部）中新增“9120 氨基酸分析指導(dǎo)原則"）。
蛋白質(zhì)或多肽樣品中的氨基酸是以結(jié)合形式存在，必須經(jīng)過水解處理，形成游離氨基酸后才能進行氨基酸測定。蛋白質(zhì)或多肽的水解方法主要采用酸水解，同時輔以堿水解。其中，酸水解中使用廣泛的是鹽酸水解，所得其產(chǎn)生的氨基酸不消旋，但該方法引起會使一些氨基酸的被全部破壞或部分破壞，如色氨酸被全部破壞，絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸被部分破壞，門冬酰胺和谷氨酰胺脫酰胺分別轉(zhuǎn)化為門冬氨酸和谷氨酸。對于這些氨基酸可采用較特殊的處理方法或者使其轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的形式，然后再進行鹽酸水解。
以利那洛肽為例，在水解過程中加入二硫代二丙酸（DTDPA）以保護半胱氨酸，考察了酸性水解條件下各氨基酸的比值情況。
液相色譜分析
色譜柱：Durashell AA, 4.6*150 mm; 3 μm; 100 ?
柱溫：45 ℃
波長：
一級氨基酸: 338 nm, 帶寬 10 nm; 參比波長: 390 nm, 帶寬 20 nm
二級氨基酸: 262 nm, 帶寬 16 nm, 參比波長: 324 nm, 帶寬 8 nm
狹縫：4 nm, 峰寬＞0.03 min
梯度洗脫程序：
時間/min | 流動相 A% | 流動相 B% | 流速 mL/min |
0 | 94 | 6 | 1.6 |
6 | 90 | 10 | 1.6 |
8 | 90 | 10 | 1.6 |
10 | 84 | 16 | 1.3 |
23 | 60 | 40 | 1.0 |
30 | 50 | 50 | 1.6 |
31 | 0 | 100 | 1.6 |
34 | 0 | 100 | 1.6 |
35 | 94 | 6 | 1.6 |
38 | 94 | 6 | 1.6 |
安捷倫進樣器自動衍生程序
序號 | 進樣器程序 | 衍生用試劑的分裝與放置位置 |
1 | 從 1 號瓶中吸取硼酸鹽緩沖液 5 μL | 往 2 mL 進樣瓶中加入 1 mL 硼酸鹽緩沖液，加帶密封墊的螺旋蓋，密封，置于進樣器樣品架的 1 號位置 |
2 | 從樣品瓶中吸取樣品 2 μL | 衍生用氨基酸標準溶液及樣品溶液置于進樣器樣品架的 8-100 號位置 |
3 | 在空氣中以最大的速度混合 7 μL，6 次 | |
4 | 等待 0.5 分鐘 | |
5 | 從 2 號瓶中吸取水 0 μL | 向 2 mL 樣品瓶中加入 2 mL 水，加不帶密封墊的螺旋蓋，置于進樣器樣品架的 2 號位置 |
6 | 從 3 號瓶中吸取 OPA 衍生劑 1 μL | 向帶內(nèi)插管的棕色樣品瓶中加入 200 μL OPA 衍生試劑，加帶密封墊的螺旋蓋，密封，置于進樣器樣品架的 3 號位置 |
7 | 在空氣中以最大的速度混合 8 μL，6 次 | |
8 | 從 6 號瓶中吸取水 0 μL | 向 2 mL 樣品瓶中加入 2 mL 水，加不帶密封墊的螺旋蓋，置于進樣器樣品架的 6 號位置 |
9 | 從 4 號瓶中吸取 FMOC 衍生劑 1 μL | 向帶內(nèi)插管的棕色樣品瓶中加入 200 μL FMOC 衍生試劑，加帶密封墊的螺旋蓋，密封，置于進樣器樣品架的 4 號位置 |
10 | 在空氣中以最大的速度混合 9 μL，10 次 | |
11 | 從 7 號瓶中吸取 50 % 乙腈溶液 0 μL | 向 2 mL 樣品瓶中加入 50% 乙腈溶液 2 mL，加不帶密封墊的螺旋蓋，置于進樣器樣品架的 7 號位置 |
12 | 從 5 號瓶中吸取稀釋劑 32 μL | 向 2 mL 樣品瓶中加入稀釋劑 2 mL，加帶密封墊的螺旋蓋，密封，置于進樣器樣品架的 5 號位置 |
13 | 在空氣中以最大的速度混合 41 μL，8 次 | |
14 | 進樣 |
輔助：
吸液速度：200 μL/min
噴液速度：600 μL/min
吸液位置：0.0 mm
注意：如果一次測定樣品數(shù)較多，需長時間連續(xù)分析，建議按樣品運行次數(shù)及時更換 5 號瓶中的稀釋劑及 2、6、7 號瓶中清洗進樣針外壁的溶劑。
表 1. 混合氨基酸對照溶液保留時間
氨基酸名稱 | 英文縮寫 | 保留時間/min |
門冬氨酸 | Asp | 1.269 |
谷氨酸 | Glu | 1.695 |
絲氨酸 | Ser | 4.989 |
組氨酸 | His | 6.885 |
甘氨酸 | Gly | 7.814 |
蘇氨酸 | Thr | 8.546 |
半胱氨酸 | Cys-X | 9.613 |
精氨酸 | Arg | 11.563 |
丙氨酸 | Ala | 12.775 |
酪氨酸 | Tyr | 15.633 |
纈氨酸 | Val | 19.574 |
甲硫氨酸 | Met | 19.918 |
正纈氨酸 | Nva（內(nèi)標） | 20.695 |
苯丙氨酸 | Phe | 22.470 |
異亮氨酸 | Ile | 22.966 |
亮氨酸 | Leu | 24.202 |
賴氨酸 | Lys | 24.703 |
肌氨酸 | Sar（內(nèi)標） | 29.484 |
脯氨酸 | Pro | 30.518 |
圖 3. 混合氨基酸對照溶水解液相色譜圖（一級氨基酸）
圖 4. 混合氨基酸對照溶液水解液相色譜圖（二級氨基酸）
圖 5. 利那洛肽水解溶液液相色譜圖（一級氨基酸）
圖 6. 利那洛肽水解溶液液相色譜圖（二級氨基酸）
表 2. 利那洛肽樣品溶液 110 ℃ 下水解測試數(shù)據(jù)
氨基酸比值 | |||
氨基酸名稱 | 英文縮寫 | 測試值 | 要求范圍 |
門冬氨酸 | Asp | 1.06 | 0.85-1.15 |
谷氨酸 | Glu | 1.00 | 0.85-1.15 |
甘氨酸 | Gly | 1.00 | 0.85-1.15 |
蘇氨酸 | Thr | 0.99 | 0.85-1.15 |
半胱氨酸 | Cys-X | 5.85 | 5.1-6.9 |
丙氨酸 | Ala | 0.94 | 0.85-1.15 |
酪氨酸 | Tyr | 1.66 | 1.7-2.3 |
正纈氨酸 | Nva（內(nèi)標） | ||
肌氨酸 | Sar（內(nèi)標） | ||
脯氨酸 | Pro | 0.95 | 0.85-1.15 |
表 3. 利那洛肽樣品溶液 150 ℃ 下水解測試數(shù)據(jù)
氨基酸比值 | |||
氨基酸名稱 | 英文縮寫 | 測試值 | 要求范圍 |
門冬氨酸 | Asp | 1.02 | 0.85-1.15 |
谷氨酸 | Glu | 0.98 | 0.85-1.15 |
甘氨酸 | Gly | 1.00 | 0.85-1.15 |
蘇氨酸 | Thr | 0.98 | 0.85-1.15 |
半胱氨酸 | Cys-X | 6.28 | 5.1-6.9 |
丙氨酸 | Ala | 0.99 | 0.85-1.15 |
酪氨酸 | Tyr | 1.89 | 1.7-2.3 |
正纈氨酸 | Nva（內(nèi)標） | ||
肌氨酸 | Sar（內(nèi)標） | ||
脯氨酸 | Pro | 1.07 | 0.85-1.15 |
結(jié)果表明，利那洛肽經(jīng)酸性水解后進行各氨基酸比值分析與理論值相符，該方法可作為多肽類藥物水解后經(jīng)衍生檢測氨基酸比值的手段，同時，建議根據(jù)不同多肽氨基酸組成優(yōu)化水解溫度、時長及巰基保護試劑以獲得更好結(jié)果。
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