人外周血白細胞分離液發(fā)展現(xiàn)狀發(fā)展趨向自主創(chuàng)新
人外周血白細胞分離液試劑盒嚴格按照人外周血白細胞分離液試劑盒說明書進行操作。操作前將試劑在室溫下平衡30～60min，加樣后及時放人孵箱。標本較多時，要分批操作，按說明步驟嚴格控制操作時間，防止孵育時間人為延長，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗*。
人外周血白細胞分離液封板溫育時，各孔一定要封嚴，防止陽性標本的液體蒸發(fā)，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn)，用洗板機洗板時，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干：還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn)。合理安排人外周血白細胞分離液檢測量，以免反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長，加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干，顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用。人外周血白細胞分離液加樣時保持顯色劑不外流，避免接觸金屬器械。加終止液時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。
人外周血白細胞分離液應(yīng)保證清潔，整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸。以上的措施可以使“花板”降至zui低限度。從而提高檢測的特異性。并得到更準確、可靠的實驗結(jié)果。人外周血白細胞分離液僅用于科研實驗，禁用于臨床。人外周血白細胞分離液效果很好，分離步驟如下：
1.在離心管中加入人外周血白細胞分離液。
2.取肝素抗凝靜脈血與等量生理鹽水充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鐘。
3. 離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿和生理鹽水，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為人外周血白細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。此外，還含有血小板。
4. 用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一短中管中，加入５倍以上體積的生理鹽水，1500rpm×10分鐘，洗滌細胞兩次。
5. 末次離心后，棄上清，此時PBMC即可用來提取RNA了。如果此時不想立即提取的話，建議你－80度保存，因為細胞內(nèi)RNA容易降解,所以一般在PBMC提取出來后立即進行RNA提取。如果因為人外周血白細胞分離液少,想積攢一批樣本后進行提取的話,PBMC的保存應(yīng)該注意了,不然就會降解的.一般降PBMC放置-80讀保存.如果你提取用的是Trizon,此時應(yīng)將Trizon試劑一起加到PBMC中保存.RNA提出后,應(yīng)該先測一下OD值,然后再跑一下電泳,這是檢驗RNA的純度和完整性,這是保證逆轉(zhuǎn)錄成功的前體,不然的話后面就會坐無用功了.
