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猴腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA試劑盒

時間:2010/5/14閱讀:1387
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猴腫瘤壞死因子TNF-αELISA試劑盒說明書

本試劑盒僅供研究                                       

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定猴血清、血漿、痰液、細胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中TNF-α含量。

概述

腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)是一種具有多種生物活性的細胞因子。猴TNF-α基因編碼前體蛋白,其信號肽將前體蛋白固定在細胞膜上,成為具有活性的跨膜干擾素(TNF),分子質(zhì)量為26×103,經(jīng)酶切去除信號肽生成分泌型TNF-α,分子質(zhì)量為17×103。TNF-α細胞來源廣泛,包括各種免疫細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、表皮細胞、角質(zhì)細胞、平滑肌細胞、星形細胞、成骨細胞等。

    TNF-α具有廣泛的生物學(xué)活性,如:參與炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答,抗腫瘤,參與內(nèi)毒素性休克等病理過程,引起惡病質(zhì)等。其具有雙重作用,,一方面在機體免疫調(diào)節(jié),機體生理功能和抗感染等方面發(fā)揮重要作用,另一方面若持續(xù)釋放或產(chǎn)生過多則會引起發(fā)熱!、休克、惡病質(zhì)等,同時TNF-α可進一步誘導(dǎo)IL-6、IL-8IL-10等細胞因子的產(chǎn)生,這些促炎性細胞因子參與體內(nèi)急性反應(yīng)、發(fā)熱反應(yīng)、引起趨化肽釋放等,還可使內(nèi)皮細胞活化而導(dǎo)致血管通透性增加。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中TNF-α水平。用純化的抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入TNF-α抗原、生物素化的抗大鼠TNF-α抗體、HRP標記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TNF-α呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。

試劑盒組成

1.         酶聯(lián)板:一塊(96孔)

2.         標準品(凍干品):2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,其濃度為10 ng/mL,做系列倍比稀釋后,分別稀釋成10 ng/mL,5 ng/mL 2.5 ng/mL,1.25 ng/mL,0.62 ng/mL,0.31 ng/mL0.16 ng/mL,其原液直接作為zui高標準濃度,樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/mL,臨用前15分鐘內(nèi)配制。

3.         樣品稀釋液1×20ml/瓶。

4.         檢測稀釋液A1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A1×120ul/瓶(1100)臨用前以檢測稀釋液A1100稀釋。稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100ul),實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A99ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制。

7.         檢測溶液B1×120ul/瓶(1100)臨用前以檢測稀釋液B1100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8.         底物溶液:1×10ml/瓶。

9.         洗滌液1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

標本的采集及保存

1.細胞培養(yǎng)物上清:請離心后收集上清,并將標本保存于-20℃,且應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.血清:標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)吮痉庞?/span>-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,或將標本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注:標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。

 

操作步驟

實驗開始前,請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線。如樣品濃度過高時,用樣品稀釋液進行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.         加樣:分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul,余孔分別加標準品或待測樣品100ul,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標板加上蓋或覆膜,37反應(yīng)120分鐘。

為保證實驗結(jié)果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.         棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul(取1ul檢測溶液A99ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制),37,60分鐘。

3.         溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干。

4.         每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100ul37,60分鐘。

5.         溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干。

6.         依序每孔加底物溶液90ul,37避光顯色(30分鐘內(nèi),此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。

7.         依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性,底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。

1 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

2.為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標板加上蓋或覆膜。

3.  未使用完的酶標板或者試劑,請于2-8保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

4.  建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,以保證檢測結(jié)果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層

水紙,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。
   
自動洗板:如果有自動洗板機,應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的猴TNF-α,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標),OD值為縱坐標(普通坐標),在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。

注意事項

1.  洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。

2.  一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。

3.  請每次測定的同時做標準曲線,做復(fù)孔。

4.  如標本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5.在配制標準品、檢測溶液工作液時,請以相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。

6.底物請避光保存。

檢測范圍:

0.15 ng/mL -10 ng/mL

說明

1.試劑盒保存:-20(較長時間不用時);2-8(頻繁使用時)。

2.有效期:6個月

3.濃洗滌液會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。

4.中、英文說明書可能會有不一致之處,請以英文說明書為準。

5.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

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