猴腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA試劑盒說明書

本試劑盒僅供研究用                                       

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測(cè)定猴血清、血漿、痰液、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中TNF-α含量。

概述

腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor，TNF）是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子。猴TNF-α基因編碼前體蛋白，其信號(hào)肽將前體蛋白固定在細(xì)胞膜上，成為具有活性的跨膜干擾素（TNF），分子質(zhì)量為26×10³，經(jīng)酶切去除信號(hào)肽生成分泌型TNF-α，分子質(zhì)量為17×10³。TNF-α細(xì)胞來源廣泛，包括各種免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、星形細(xì)胞、成骨細(xì)胞等。

    TNF-α具有廣泛的生物學(xué)活性，如：參與炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答，抗腫瘤，參與內(nèi)毒素性休克等病理過程，引起惡病質(zhì)等。其具有雙重作用，,一方面在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，機(jī)體生理功能和抗感染等方面發(fā)揮重要作用，另一方面若持續(xù)釋放或產(chǎn)生過多則會(huì)引起發(fā)熱!、休克、惡病質(zhì)等，同時(shí)TNF-α可進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-6、IL-8、IL-10等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些促炎性細(xì)胞因子參與體內(nèi)急性反應(yīng)、發(fā)熱反應(yīng)、引起趨化肽釋放等，還可使內(nèi)皮細(xì)胞活化而導(dǎo)致血管通透性增加。

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中TNF-α水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入TNF-α抗原、生物素化的抗大鼠TNF-α抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TNF-α呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

試劑盒組成

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為10 ng/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10 ng/mL，5 ng/mL ，2.5 ng/mL，1.25 ng/mL，0.62 ng/mL，0.31 ng/mL，0.16 ng/mL，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         檢測(cè)稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測(cè)稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測(cè)溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液A1：100稀釋。稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

7.         檢測(cè)溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測(cè)溶液A。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標(biāo)本的采集及保存

1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2．血清：標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓?/span>加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。

為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.         棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100ul（取1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37℃,60分鐘。

3.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。

4.         每孔加檢測(cè)溶液B工作液（同檢測(cè)A工作液） 100ul，37℃，60分鐘。

5.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。

6.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

注：

1． 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。

3.  未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液、檢測(cè)溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液或檢測(cè)溶液B工作液。

4.  建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層

吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
    自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

特異性

    本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的猴TNF-α，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項(xiàng)

1．  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2．  一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

3．  請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。

4．  如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

6．底物請(qǐng)避光保存。

檢測(cè)范圍：

0.15 ng/mL -10 ng/mL

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。

2．有效期：6個(gè)月

3．濃洗滌液會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

4．中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn)。

5．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。