TUNEL原位檢測試劑盒（細胞）（FITC標記POD法）（TdT酶介導的原位末端標記dUTP檢測試劑盒）（DNA片段化檢測試劑盒）
Cat number：KGA
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Expire date：
For Research Use Only
凱基TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒
（FITC標記POD法,細胞樣本）
使用說明書
Cat：KGA7024,7034,7044
（20,50,100Tests）
目 錄
一、 TUNEL檢測原理
二、試劑盒組分
三、檢測樣本的預處理
1．細胞樣本的準備
2．陽性對照及陰性對照的準備
四、 標記及顯色反應
五、 常見問題的原因及*解決方案
一、TUNEL試劑盒說明
凱基TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（FITC標記POD法）是用來檢測細胞在凋亡過程中細胞核DNA的斷裂情況，其原理是熒光素（fluorescein）標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以連接到凋亡細胞中斷裂的DNA的3‘－OH末端，可用熒光顯微鏡檢測；熒光素亦可被抗熒光素抗體（anti-fluorescein antibody）標記,，在辣根過氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）的存在下，產(chǎn)生很強的顏色反應（呈棕色），特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在普通光學顯微鏡下即可觀察和計數(shù)凋亡細胞。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被標記或染色。本試劑盒適用于細胞樣本（細胞涂片）的凋亡原位檢測。
本試劑盒特點
● 操作簡便：使用Ready-to-Use型試劑，配有DAB。
● 高靈敏度：可以單一檢出初期的凋亡細胞。
● 高特異性：能特異性染色凋亡細胞。
● 快速操作：整體操作約需3小時。
● 方便觀察：可使用熒光顯微鏡觀察實驗結果，亦可在信號轉換后使用光學顯微鏡觀察實驗結果。
● 高正確性：有陽性對照片的制備方法，可以確認試劑盒的有效性
二、TUNEL試劑盒組分
| 組 份 | Cat: KGA-7024 20 assays | Cat: KGA-7034 50 assays | Cat: KGA-7044 100 assays | 儲存條件 |
| Equilibration Buffer | 1.0 mL | 2.5 mL | 5.0 mL | -20℃ |
| FITC-12-dUTP | 20μL | 50μL | 100μL | -20℃ |
| TdT Enzyme | 80μL | 200μL | 400μL | -20℃ |
| anti-fluorescein antibody | 200μL | 500μL | 1000μL | -20℃ |
| DAB | 2mg | 5mg | 10 mg | -20℃ |
注意事項
1．使用前請認真閱讀本說明書，提前準備好相關試劑。
2．因本試劑盒中組分均為微量，使用前請離心集液。
3．為避免試驗誤差、降低試劑的損耗，建議使用精密度高的進口微量移液槍及槍頭。
4．TdT 酶反應液在使用前根椐樣本數(shù)量集中配制，再分別滴加于各樣本片上，避免每個樣本單獨配制而產(chǎn)生的試劑損耗。
5．另因DAB為固體粉末，使用前加入適量PBS溶解，配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按下述方法顯色使用。
6． 用戶自備：多聚甲醛、PBS、H2O2 、TritonX-100、檸檬酸鈉、復染蘇木素染液、蓋玻片、載玻片、染色缸。
三、檢測樣本的預處理
TUNEL檢測時樣本的預處理是試驗的關鍵所在，本說明書*的條件僅為普遍情況，用戶需根椐自已的樣本材料及*試驗結果來調整各個條件（參照Page 8），如處理時間、處理濃度等，來優(yōu)化出適合自身樣本的試驗條件，從而做出客觀的試驗結果。
1．細胞樣本的準備.
操作注意事項：
1．為防止樣本脫落，請使用硅烷（Silane）處理的載玻片或采用多聚賴氨酸鋪片。
2． 固定好的樣本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分鐘或至過夜，以改善細胞的滲透性。
3．使用PBS清洗細胞樣本時，不要直接加在細胞樣本上，以防止細胞樣本的脫落。
4． 進行PBS清洗時，以5分鐘清洗3次為標準。
5． 固定液、PBS、封閉液、通透液、染色缸需用戶自備，請按上述方法配制。
2．陽性對照及陰性對照的準備
TUNEL檢測同時需要設陽性和陰性對照，以顯示試驗的客觀性及準確性。因此需要按下述方法準備兩個樣本來制備陽性及陰性片，其后續(xù)步驟與待測樣本同樣進行。
A：陽性對照樣本的準備
細胞樣本在Triton X-100通透液處理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反應液（10U～3000U DNase I，40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2）（用戶自備）室溫～37℃處理10～30 min，其余步驟均相同。如有問題詳見Page 8.
B：陰性對照樣本的準備
在Page 6標記反應制備TdT酶反應液時，不添加TdT酶，其余步驟均相同。
四、標記和顯色反應
操作注意事項：
1. 進行PBS清洗時，以5分鐘清洗3次為標準。
2. PBS清洗后，為了各種反應的有效進行，請盡量除去PBS溶液后再進行下一步反應。
3. 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應液后，請蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進行，這樣可以使反應液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應液干燥造成實驗失敗。
4. TdT酶反應液即用即配，短暫于冰上保存。不宜*保存，*保存會導酶活性的失活。
5.如果20×DAB溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。
6.蘇木素復染：將切片放入蘇木素染液，染色 30min ，蒸餾水沖洗干凈后放入鹽酸甲醇溶液中5s，立即用蒸餾水沖洗干凈。分別用70%、85%、95%、無水乙醇浸泡5分鐘。用二甲苯浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘。晾干后在切片上加中性樹膠，加蓋玻片。
| 現(xiàn)象 | 可能原因 | 建議 |
| 非特異性染色 | TdT酶的濃度過高 | 用TdT dilution buffer* 作1：2～1：10稀釋 |
| 內(nèi)源過氧化物酶未被封閉 | 封閉液室溫（15-25℃）封閉10min（封閉液： 3%H2O2溶于甲醇） | |
| Anti-fluorescein-POD 非特異性結合 | l anti－mouse serum封閉 l 3％BSA溶于PBS封閉20min l 稀釋HRP工作液濃度至50％ | |
| 固定后某些核酸酶活性依然較高 | 用含有dUTP和 dAPT的溶液封閉 | |
| 染色背景較高 | 福爾馬林固定導致某些含黑色素前體的細胞染成黃色 | 嘗試以甲醇固定，但可能會降低檢測的敏感性。 |
| 內(nèi)源過氧化物酶未被封閉 | 封閉液室溫（15-25℃）封閉10min（封閉液： 3%H2O2溶于甲醇） | |
| Anti-fluorescein-POD 非特異性結合 | l anti－mouse serum封閉 l 3％BSA溶于PBS封閉20min l 稀釋工作液濃度至50％ | |
| 樣本被支原體污染 | 使用支原體檢測試劑盒檢測，如陽性則制備未被污染的新樣本 | |
| 標記反應試劑的濃度過高 | 稀釋50%，以降低標記反應的濃度*TdT dilution buffer：60 mM KPB 緩沖液（pH7.2），150 mM KCl， 1 mM 2-ME， 50 % Glycerol | |
| 細胞處于高度增殖期 | 使用Annexin –V-Flous雙重著色 | |
| DAB孵育時間過長 | 減少DAB染色時間 | |
| 標記率低、染色淡至無 | 如果以乙醇或甲醇固定的樣本則標記效率較低（因為在固定時染色質未能與蛋白質交聯(lián)，而在操作中丟失） | 用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定 或福爾馬林或戊二醛固定。 |
| 過度的固定導致與蛋白過度交聯(lián) | 縮短固定時間，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定 | |
| 促滲條件不佳，以致于試劑不能到達靶分子或濃度過低 | l 增加通透劑促滲時間 l 增加通透劑的作用溫度（15～25℃） | |
| 復染信號較弱 | 選擇的染料不合適 | 用溶于0.1M醋酸*的5%甲基綠PH4.0，或蘇木素復染 |
| 陽性對照沒有信號 | DNase I的濃度過低 | l 一般樣本使用1－10U/ml DNase I l 反應緩沖液：10mM Tris-HCl PH 7.4 10 mM NaCl, 5mM MnCl2, 0.1mM CaCl2 25mM KCl2 37℃ 反應30 min，PBS洗去。 |
五 常見問題的原因及*解決方案.
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