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ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)操作的影響
閱讀：209 發(fā)布時(shí)間：2023-2-28 ELISA測定中影響因素較多，操作過程中每個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。以下是ELISA試驗(yàn)操作中的影響因素：
1、加樣
孵育前加樣時(shí)間過長，酶試劑加出孔外，使用滴瓶滴加試劑時(shí)，滴加的角度不同和擠壓的力度不同，致使滴加的試劑量不準(zhǔn)，都可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。控制方法：
①實(shí)驗(yàn)樣本過多時(shí)，可分批次操作，以減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長造成的誤差；
②加酶試劑后，用吸水紙吸干孔外試劑；
③作定量試驗(yàn)時(shí)，使用加樣器加注試劑，并經(jīng)常校正其準(zhǔn)確性，此外，要做到一份樣本一個(gè)移液頭，防止交叉污染。
2、溫育
溫育是ELISA測定最為關(guān)鍵、最容易出現(xiàn)問題的步驟。最為常見的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2-8℃。目前國內(nèi)售ELISA試劑盒溫育時(shí)間為37℃，30 min-1 h，進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃，1-2 h能有較wan全的結(jié)合。
1）、溫育時(shí)間、溫度的選擇一般根據(jù)試劑盒的說明書選擇溫育的時(shí)間、溫度。
加完樣本和（或）試劑后將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中時(shí)，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃需要一定時(shí)間，如果是將微孔板一放入溫箱即開始計(jì)時(shí)，這樣就容易造成實(shí)際測定中溫育時(shí)間不夠，易致弱陽性標(biāo)本測不出來?？刂品椒ǎ孩偃缬袃煞N溫度，盡量使用較低的溫育溫度、較長反應(yīng)時(shí)間的條件；②用1個(gè)小溫度計(jì)放置在板孔反應(yīng)液中測量觀察。
2）、“邊緣效應(yīng)"的排除“邊緣效應(yīng)"是在使用96孔板的ELISA測定中，外周孔顯色較中心孔深的現(xiàn)象。產(chǎn)生的原因可能是為96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學(xué)梯度造成的，因此在溫育時(shí)盡量采用水浴。
3、洗板
ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機(jī)洗板。采用手工洗板，孔與孔之間液體易交叉，采用半自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，洗液量不足導(dǎo)致洗板不徹di，洗板針堵塞導(dǎo)致抽吸不wan全，洗板不暢導(dǎo)致清洗效果差。控制方法：
①手工洗板時(shí)，拍板時(shí)要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離；
②洗板機(jī)洗板時(shí)應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時(shí)可用注射器針頭挑出；
③為了洗滌效果好，實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法，在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1-2次，或適當(dāng)增加洗板的次數(shù)，有資料報(bào)道洗板7次能達(dá)到理想的洗滌效果[5]
4、顯色
市售ELISA試劑盒中，如以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液；如以鄰苯二胺(OPD)為底物，則試劑盒提供鄰苯二胺片劑或粉劑。顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15-30 min。以鄰苯二胺(OPD)為底物的試劑，要臨用前30 min配制且必須避光。以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物的試劑則不需避光，但A、B液應(yīng)盡量避免接觸金屬器械。
5、結(jié)果判定
讀取結(jié)果要在15-30 min內(nèi)完成，定性測定用肉眼判讀試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，反應(yīng)板應(yīng)水平距離白色背景10-15 cm；定量測定時(shí)用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果，酶標(biāo)儀不應(yīng)置于陽光或強(qiáng)光照射下，需先預(yù)熱15-30 min再進(jìn)行測試。
綜上所述，盡管ELISA法操作簡單，但可能影響測定結(jié)果的因素也較多。故在實(shí)際操作的過程中，要加強(qiáng)質(zhì)量管理，認(rèn)真避免或減少影響因素，力求結(jié)果準(zhǔn)確，為疾病的診斷和科研提供可靠的依據(jù)。