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流式細(xì)胞技術(shù)常見(jiàn)問(wèn)題與回答

時(shí)間:2012-8-7閱讀:9505

1、流式細(xì)胞儀上的FL2-W FL2-A FL2-H 分別是做什么的?
FL2-W是只檢測(cè)熒光的脈沖寬度, FL2-H是指脈沖高度。通常在做細(xì)胞周期分析時(shí)應(yīng)用,用于去除粘連細(xì)胞。

2、流式同型對(duì)照怎樣選擇?
同型對(duì)照(Isotype Control):使用與一抗相同種屬來(lái)源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白,用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色。如果一抗是多抗,可以用an normal serum(與一抗相同的正常血清) (must be the same species as primary antibody)。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.這個(gè)可以咨詢(xún)?cè)噭┥?。同型?duì)照為免疫熒光標(biāo)記中的陰性對(duì)照。由于熒光標(biāo)記單抗的組來(lái)源不同,應(yīng)選用相同來(lái)源的未標(biāo)記單抗作為同型對(duì)照來(lái)調(diào)整背景染色。舉個(gè)例子:比如檢測(cè)一抗為單抗的mouse anti rat CD11b,clone OX-42 purified IgG,那么它的isotype 是mouse IgG2a, 所以可以用purified(純化的) mouse IgG2a來(lái)做OX-42的同型對(duì)照(Isotype Control)。一般的的生物技術(shù)公司和國(guó)內(nèi)的代理都有出售。

同型對(duì)照:是指與MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亞類(lèi),若使用直接免疫熒光染色法,同型對(duì)照也應(yīng)標(biāo)記熒光色素,如IgG1 FITC、IgG2a、PE等。主要考慮了細(xì)胞的自發(fā)熒光、FC受體介導(dǎo)的抗體結(jié)合和非特異性抗體結(jié)合等影響因素。此外,同型對(duì)照與MoAb所標(biāo)記的熒光色素、濃度、F:P比值(標(biāo)記的熒光色素與免疫球蛋白分子的比值)應(yīng)該相同為*,這對(duì)準(zhǔn)確設(shè)定陰性與陽(yáng)性細(xì)胞的界標(biāo)有重要意義,切忌使用與MoAb不相匹配的同型對(duì)照,為同一實(shí)驗(yàn)室、采用相同工藝或方法制備(如同一品牌)的產(chǎn)品。

3、流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度為何要使用氯化鈣.在文獻(xiàn)及其他專(zhuān)業(yè)中都有測(cè)定游離鈣的方法,具體如下:
(1) 鈣熒光探針負(fù)載;
(2)隨機(jī)測(cè)定每管細(xì)胞懸液樣品(以下簡(jiǎn)稱(chēng)樣品)的單個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度,記為F值。
(3)加入10%Triton X 100,(破膜用);加入1 mmol/L氯化鈣,(問(wèn)題所在),吹打均勻,孵育1~10min,測(cè)定熒光即Fmax值。
(4)加入EGTA,20%26mu;l(鈣螯合劑),孵育1~10min,激發(fā)波長(zhǎng)488nm測(cè)定熒光,即Fmin值。
這個(gè)過(guò)程中的氯化鈣的作用如何, 請(qǐng)高人指點(diǎn), 謝謝。
因?yàn)檎Q獫{中Ca2+濃度是1mM,細(xì)胞外液的Ca2+對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+有影響。加0.1%triton是增加膜通透性,使細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),作為zui大值。加EGTA是為了螯合Ca2+,作為zui小值.生理環(huán)境中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度遠(yuǎn)低于細(xì)胞外液(大約1:10000),細(xì)胞膜對(duì)鈣的通透性變化對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣影響很大。

4、流式與werstern的區(qū)別,知道一些,不足之處請(qǐng)大家補(bǔ)充:
(1)Western 是檢測(cè)蛋白表達(dá)的金標(biāo)準(zhǔn),可用于檢測(cè)細(xì)胞多種類(lèi)型的蛋白;流式細(xì)胞術(shù)的方法多用于檢測(cè)細(xì)胞膜蛋白,雖然也可通過(guò)Triton-X100給細(xì)胞打孔的方法來(lái)檢測(cè)胞內(nèi)蛋白,但對(duì)于分泌蛋白卻是無(wú)能為力的;
(2)Western測(cè)蛋白含量對(duì)抗體的量需要很少,一般1:1000左右,而流式對(duì)抗體的需要量很大,一般1:50(很浪費(fèi)抗體);
(3)采用Western方法檢測(cè)細(xì)胞蛋白含量的變化一般要有內(nèi)參,而流式一般要把每個(gè)樣品分為兩份,同時(shí)都做只加二抗(FITC標(biāo)記的)的對(duì)照,這樣平均到每個(gè)細(xì)胞的發(fā)光就不用內(nèi)參了;
(4)就個(gè)人經(jīng)驗(yàn)而言,流式用多抗不好,單抗標(biāo)出來(lái)不錯(cuò)。
不過(guò)流式的應(yīng)用原理主要還是抗原和抗體反應(yīng)和western、免疫組化沒(méi)有本質(zhì)差別,但是由于免疫組化和western都有酶催化底物的放大體系,因此,流式不適合檢測(cè)低表達(dá)的蛋白,低表達(dá)的還是采用western(尤其是化學(xué)發(fā)光底物更佳)和免疫組化更好。當(dāng)然,流式zui大的一個(gè)特點(diǎn)就是,可以定量(百分比),如果是高表達(dá)的用流式細(xì)胞儀非常有優(yōu)勢(shì)。

5、FL1, FL2, FL3 的區(qū)別是什么? 是指在不同位置測(cè)得的熒光?還是不同波長(zhǎng)的熒光?這3個(gè)參數(shù)到底測(cè)的是什么?有什么意義?
其實(shí)FL1, FL2, FL3 是指不同的熒光通道.舉個(gè)例子來(lái)說(shuō)吧.我們用FITC/PE雙標(biāo)記的細(xì)胞,在488nm的激光激發(fā)下,這兩種熒光染料分別發(fā)出波長(zhǎng)不同的綠色和橙色熒光,然后這發(fā)出的熒光再通過(guò)濾光片分開(kāi),對(duì)應(yīng)的是不同的波長(zhǎng)的濾光片,一般在fl1那的是530nm的濾光片,在FL2那的是575nm的濾光片,這樣就可以把在一起的熒光分開(kāi)了。
6、用于做Western 或ELISA的一抗可否用于流式細(xì)胞術(shù)?
看你說(shuō)明書(shū)上是怎么說(shuō)的了,如果沒(méi)有說(shuō)就不可以做流式,需要另外買(mǎi)了。
7、MFI和GFI的意義?
Geo Mean,叫做幾何均數(shù)(geometric mean),常用于等級(jí)資料和對(duì)數(shù)正態(tài)分布資料,和常用的算數(shù)均數(shù)(mean)的計(jì)算方法不同。%26ldquo; %total或者%gate的結(jié)果%26rdquo;代表的是百分率,即細(xì)胞占總體細(xì)胞或者是門(mén)內(nèi)細(xì)胞的百分比;用百分比作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo),適用于熒光表達(dá)較強(qiáng)的指標(biāo)。我看到你的流式圖上,檢測(cè)樣本的熒光強(qiáng)度不是很強(qiáng),屬于弱表達(dá)的指標(biāo),若用百分率統(tǒng)計(jì),就是會(huì)失去一部分弱陽(yáng)性的數(shù)據(jù)。我建議可以用平均熒光強(qiáng)度(也就是mean值)作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo),比較熒光強(qiáng)度的變化。
8、流式技術(shù)中的APC,pure 標(biāo)記是什么意思呢?
熒光物質(zhì)通常是指那些在受到一個(gè)波長(zhǎng)激發(fā)后,處于一個(gè)能量不穩(wěn)定的狀態(tài),能發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)比激發(fā)波長(zhǎng)長(zhǎng)的光的一類(lèi)物質(zhì)。當(dāng)然熒光并不都是受激發(fā)后發(fā)射的,如一些生物可以發(fā)射熒光,如熒火蟲(chóng),發(fā)光細(xì)菌等,他們發(fā)出的光是通過(guò)體內(nèi)的酶促反應(yīng)而產(chǎn)生的,這個(gè)酶通常被稱(chēng)為熒光素酶.EB是一種熒光物質(zhì),它在受到紫外線(xiàn)照射后可以發(fā)出一可見(jiàn)光,常用于DNA、RNA電泳中。
APC
英文全名:allophycocyanin;中文名:別藻青蛋白;zui大吸收峰:650nm,zui大發(fā)射熒光峰:660nm,適用于雙激光流式儀,可被600-640nm波長(zhǎng)的激光激發(fā)。
PerCP
英文全名:peridinin chlorophyll protein,中文名:多甲藻葉綠素蛋白;zui大激發(fā)波峰490nm,被488nm的氬離子激光激發(fā)后,發(fā)射光峰值約為677nm,與FITC、PE進(jìn)行多色熒光染色補(bǔ)償重疊較少,非特異性結(jié)合也較少。雖然較易使用,但量子產(chǎn)量不高,多用于檢測(cè)表達(dá)較高的抗原。
9、怎樣用流式細(xì)胞儀來(lái)鑒定小鼠BMDC?
檢測(cè)小鼠BMDC主要是從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面分子兩方面來(lái)鑒定我做的時(shí)候就做了普通光鏡下形態(tài)、電鏡(掃描和透射),另外檢測(cè)了小鼠BMDC表面的共刺激分子如CD86 、CD11、CD80。還做了MHC II類(lèi)分子的檢測(cè),還有MHCI類(lèi)分子的檢測(cè),這些分子在DC表面都不是特異存在的,在巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞表面也有表達(dá),所以目前并沒(méi)有非常特異性的方法檢測(cè)你的細(xì)胞一定就是DC,但是從形態(tài)和表面分子的檢測(cè)結(jié)合來(lái)看,效果就比較好了.一般在幼稚的DC上述分子表達(dá)水平較低,DC成熟過(guò)程中,上述分子表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì),你可以在不同的培養(yǎng)時(shí)間分別檢測(cè)。

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