谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B C10H17N3O6S 

pGEX載體表達(dá)的外源蛋白與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合，因此可以通過谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化。GSTs是一類以谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）作為底物，通過形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST對(duì)底物的親和力是亞毫摩爾級(jí)的，因此谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹脂對(duì)GST及其融合蛋白的純化效率很高?？梢杂煤坞x谷胱甘肽的緩沖液洗脫結(jié)合GST融合蛋白。樹脂用3mol/L NaCl的緩沖液再生。谷胱甘肽瓊脂糖對(duì)GST融合蛋白的結(jié)合能力很強(qiáng)（每毫升柱床體積的樹脂能結(jié)合8毫克融合蛋白）。

特性:    粒度：45-165µm                        流速：75cm/h               工作PH：4-10                        耐壓：0.3Mpa    載量：＞5mg 谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶

使用說明：

谷胱甘肽樹脂的處理:

1.輕輕顛倒盛有谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的容器，將樹脂混成勻漿。

2.取部分勻漿放入15mL聚丙烯管（每100mL 細(xì)菌培養(yǎng)物大約需要2mL 勻漿）。

3.4℃ 500 g離心5分鐘，小心去掉上清。

4.在樹脂中加入10倍柱床體積預(yù)冷的PBS，顛倒數(shù)次混勻，4℃ 500 g離心5分鐘，小心去掉上清。

5.每毫升樹脂加入1毫升冷的PBS，制成50%勻漿，顛倒數(shù)次，混合均勻，懸液冰上放置待用。制備細(xì)胞抽提物：

6.每100毫升培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀重懸于4mL PBS緩沖液中。

7.加入溶菌酶至終濃度為1mg/mL,冰上放置30分鐘。

8.用針筒將10mL 濃度為0.2%的TritonX-100 強(qiáng)行注入黏稠的細(xì)胞裂解物中，劇烈振動(dòng)數(shù)次混勻。加入DNase和RNase至終濃度5ug/mL, 4℃振動(dòng)溫育10分鐘，4℃ 3000 g離心30分鐘，去除不溶性細(xì)胞碎片，上清轉(zhuǎn)移到一只新管中，加入DTT至終濃度1mmol/L。純化融合蛋白：

9.細(xì)胞裂解物與適量50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混和，每100毫升細(xì)菌培養(yǎng)物加2mL樹脂，于室溫輕搖30min。

10.混合物于4℃以500 g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

11.沉淀中加入10倍柱床體積的冷的PBS，顛倒離心管數(shù)次混勻，洗去未與樹脂結(jié)合的蛋白。

12.4℃以500 g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

13.重復(fù)步驟11和12兩次。

14.結(jié)合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫液洗脫，也可用凝血酶、腸激酶或Xa 因子切割，釋放靶蛋白。

用谷胱甘肽洗脫融合蛋白：

15.沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液，室溫輕輕攪動(dòng)10min，洗脫樹脂上結(jié)合的蛋白。

16.4℃以500 g離心5分鐘，上清（含洗脫的融合蛋白）移至新管中。

17.重復(fù)步驟a和b兩次，合并3次上清。蛋白酶解從結(jié)合的GST融合蛋白上回收靶蛋白：

18.在結(jié)合了融合蛋白的樹脂中加入凝血酶、腸激酶或Xa 因子（根據(jù)融合蛋白中的位點(diǎn)選擇），每mL樹脂加入50單位溶于1mLPBS的蛋白酶。顛倒離心管數(shù)次混勻，室溫下振蕩2—16小時(shí)。用小規(guī)模實(shí)驗(yàn)確定精確時(shí)間。

19.4℃以500 g離心5分鐘，上清小心移至新管中。（GST仍結(jié)合在樹脂上，而靶蛋白在上清中，蛋白酶也在上清中，仍需要分離）

20.10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析每一步樣品的蛋白質(zhì)組成。試劑配制：谷胱甘肽洗脫緩沖液：10mmol/L還原型谷胱甘肽，50mmol/L Tris-Cl (pH8.0)