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| 供貨周期 | 一周 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 生物產(chǎn)業(yè) |
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快速病毒RNA免核酸提取
SYBR Green熒光PCR檢測試劑盒
試劑盒簡介：本試劑盒中采用du特配方，能夠快速高效的裂解各種常見樣本，無需重復(fù)離心便可獲得高質(zhì)量的病毒RNA，適用于以RNA為模板的定量PCR的檢測。本產(chǎn)品可用于細(xì)胞培養(yǎng)液、血液、血清中病毒RNA的提取。
組分 | M-DNA01 |
RNA-Lysis | 1.5 mL （50T） |
2×one step SYBR Green Mix | 200 μL ( 50T ) |
50 μL ( 50T ) | |
樣品稀釋液 | 20 ml ( 50T ) |
保存期：-20oC 保存，保存期一年。
注意：使用前將RNA-Lysis室溫充分混勻。
一、 樣品的處理方法
1.少量樣本處理方法
（1）吸取15μL樣本放入1.5ml離心管中。
（2）加入25 μL RNA Lysis。
（3）充分混勻,室溫靜置5分鐘，加入350µL樣品稀釋液混勻。
（4）10,000rpm離心1分鐘，取1-2μL作為PCR反應(yīng)模板。
2.大量樣本處理方法
（1）分別吸取15μL不同的樣本依次放入8聯(lián)管中。
（2）加入25 μL RNA Lysis。
（3）充分混勻,室溫靜置5分鐘，10,000rpm離心1分鐘。
（4）分別從（3）中吸取10μL處理后樣品依次加入一新的8聯(lián)管。
（5）每孔分別加入90µL樣品稀釋液混勻。取1-2μL作為熒光PCR反應(yīng)模板。
二、在RNase free 的離心管中配制PCR反應(yīng)體系(以ROCH 480 為測試機型)
PCR反應(yīng)體系 | 20 μL體系（推薦） |
2×one step SYBR Green Mix | 10 μL |
SYBR Green Enzyme | 1μL |
Forward Primer (10 μM) | 0.4-1μL |
Reverse Primer (10 μM) | 0.4-1 μL |
Template RNA | 1-2 μL |
ddH2O | 補足至20 μL |
三、反應(yīng)程序
溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) | |
逆轉(zhuǎn)錄 | 50oC | 15min | 1 |
預(yù)變性 | 95oC | 30sec | 1 |
循環(huán)反應(yīng) | 95oC | 10sec |
40-45 |
60oC | 30sec | ||
溶解曲線 | 95oC | 5sec | 1 |
55oC | 1min | 1 | |
97oC | - | 1 |
對于有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的模板，可以將逆轉(zhuǎn)錄溫度提高到55oC，有助于提高擴增效率；
延伸時間請根據(jù)使用儀器所需要的數(shù)據(jù)采集最短時間進行調(diào)整；
溶解曲線的設(shè)定，根據(jù)儀器的默認(rèn)采集程序設(shè)定即可。
（1）在進行大量樣品檢測時，可將本試劑盒的試劑預(yù)分裝到8聯(lián) PCR管，用多通道移液器進行多樣本的處理。
（2）取樣的細(xì)胞量應(yīng)當(dāng)適中，濃度不宜過高或過低，處理后溶液應(yīng)當(dāng)以透明為宜。擴增病毒基因時需要根據(jù)病毒的滴度決定取樣的細(xì)胞數(shù)量。
（3）樣品處理過程中應(yīng)當(dāng)防止交叉污染，推薦設(shè)置陰性樣品參與處理過程，以檢測環(huán)境的污染。
（4）PCR的退火溫度可根據(jù)引物的預(yù)測Tm值減去5℃，或者通過梯度PCR摸索最佳退火溫度。
（5）用本試劑盒處理的樣品可于-20℃保存 1個月。
（6）為防止試劑盒污染，請勿將不同批號試劑盒混用。
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