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熒光定量PCR實驗是分子實驗室常用的一項技術(shù)。持續(xù)關(guān)注小翊的應(yīng)該都掌握了高質(zhì)量cDNA的獲取方法，引物設(shè)計指南以及反應(yīng)體系的配制技巧（還未get的小伙伴戳文末鏈接），然而上機(jī)時，發(fā)現(xiàn)和別人的反應(yīng)條件不一致卻又不敢動儀器？本期小翊將帶你玩轉(zhuǎn)qPCR儀器的設(shè)置！
目前市面上的qPCR儀器種類五花八門，但基本上儀器的設(shè)置都相對一致。我們以ABI 7500為例進(jìn)行介紹。
- 反應(yīng)板設(shè)置
- 實驗?zāi)康倪x擇：我們將實驗命名為“Yeasen”，進(jìn)行“Quantitation： Δ Δ Ct”
實驗。
- 實驗方法選擇：如選用SYBR Green標(biāo)記方法， 標(biāo)準(zhǔn)程序。
- 目的基因和模板的設(shè)置：每個Target和Sample命名，Target包括目的基因、內(nèi)參基因，Sample包括實驗組、對照組、負(fù)對照組。
- 反應(yīng)孔的設(shè)置：根據(jù)樣品的排布選中面板上的加樣孔，勾選左邊對應(yīng)的目的基因及模板。
注意：不應(yīng)為了方便將所有孔選成同一個Target同一個Sample，這樣排布會造成比較大的風(fēng)險。我們通過下面的例子進(jìn)行說明：
（圖源自網(wǎng)絡(luò)）
我們同一塊板上同時擴(kuò)增兩個基因，而布孔時選成同一個Target，那么儀器默認(rèn)的都是同一個閾值，假如布孔時都選成Target1，紅色這條閾值線對于Target1是合理的，但對于Target2則不合理，因為這時已經(jīng)不在指數(shù)擴(kuò)增期，得到的Ct值并不可信。
- 反應(yīng)程序設(shè)置
- 擴(kuò)增程序
- 預(yù)變性
qPCR的模板可以是cDNA或gDNA，預(yù)變性這一步可以使雙鏈DNA或cDNA-RNA結(jié)合物解鏈，以利于引物更好的和模板結(jié)合。另外在使用熱啟動Taq酶的反應(yīng)中，還可激活Taq酶，從而使反應(yīng)得以順利進(jìn)行。如Yeasen Hieff系列定量產(chǎn)品的預(yù)變性設(shè)置為95℃ 5min。
- 變性
qPCR反應(yīng)的產(chǎn)物比較短，一般10-30s的變性時間就已足夠。
- 退火/延伸
qPCR反應(yīng)可以將退火與延伸兩步進(jìn)行合并。條件需要根據(jù)引物和目的基因的長度進(jìn)行調(diào)整，根據(jù)qPCR引物設(shè)計原則，引物的Tm值在60℃左右，因此這一步的溫度一般可設(shè)為60℃。時間還需根據(jù)儀器使用要求進(jìn)行設(shè)置，如ABI StepOne、Bio-Rad CFX96、Roche LightCycler 480至少需要設(shè)置30s，而ABI 7500則至少需要設(shè)置34s。
- 循環(huán)數(shù)
循環(huán)階段從變性到退火、延伸，循環(huán)數(shù)一般設(shè)為40。
- 熒光信號采集
對于染料法而言，兩步法檢測的熒光信號采集應(yīng)該在退火延伸的整合步驟；三步法應(yīng)當(dāng)在72℃延伸時采集，此時絕大部分的DNA是雙鏈狀態(tài)；Taqman法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。以ABI 7500為例，選擇在哪一步采集熒光信號點亮其下面的小方塊即可。
注：市面上不同公司生產(chǎn)的熒光定量產(chǎn)品的反應(yīng)程序有所不同，建議根據(jù)說明書推薦的程序進(jìn)行設(shè)置，以得到蕞優(yōu)的擴(kuò)增效率。
- 熔解程序
使用染料法進(jìn)行熒光定量PCR時，我們通常會在擴(kuò)增階段完成后進(jìn)行熔解曲線分析，幫助確定產(chǎn)物類型，判斷是否有非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生。以SYBR Green法為例，SYBR Green染料只有結(jié)合到雙鏈DNA的小溝中才能發(fā)出熒光，擴(kuò)增反應(yīng)完成后，對產(chǎn)物逐漸升溫同時監(jiān)測每一步的熒光信號，隨著溫度升高，DNA雙鏈解開，產(chǎn)物熒光信號下降。溫度一般設(shè)置在60℃-95℃區(qū)間，能包含產(chǎn)物Tm值和非特異產(chǎn)物Tm值即可。在某個溫度下，雙鏈DNA會解鏈一半，此后剩下的一半會迅速解鏈，熒光驟降并形成變化的拐點，這個溫度稱為退火溫度（Tm值）。將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)作圖(-dI/dT)，從而生成熔解曲線。
Tm值受產(chǎn)物長度，GC含量和離子環(huán)境等影響。因為目的產(chǎn)物長度在80-300bp，Tm值一般高于80℃，而引物二聚體比較小，大多Tm值低于75℃。而同一產(chǎn)物Tm值用不同品牌的試劑擴(kuò)增時，Tm值會有所區(qū)別也是因為buffer成分的不同，如含有促解鏈的DMSO成分多，Tm值則相對低一點。
熔解曲線通常情況下可以使用儀器默認(rèn)程序或者是儀器說明書上建議的程序，無需變動。
這幾個步驟設(shè)置好，可以保存、修改或者直接點擊“START RUN”進(jìn)行反應(yīng)。
- 結(jié)果分析
- 閾值設(shè)置（可選）
Ct值是擴(kuò)增曲線和閾值線的交點對應(yīng)的循環(huán)數(shù)，閾值改變Ct值也會隨之變動。但實際上，只要將閾值線設(shè)定在合適的范圍內(nèi)，任何兩個樣品間的△Ct值都會保持不變，依然可以依據(jù)△Ct值來計算不同樣本間基因表達(dá)量的倍數(shù)變化。
閾值線不能太低，否則會受到噪音信號的干擾。反之，如果設(shè)置的太高，到達(dá)擴(kuò)增線性期或平臺期，數(shù)據(jù)則不準(zhǔn)確，設(shè)置方法有兩種：
- 設(shè)為儀器默認(rèn)值。點擊Analyze（分析）按鈕時，軟件會自動為我們的實驗設(shè)置好每一個Assay的蕞佳閾值線。
- 手動設(shè)置?？砂醋￠撝稻€上下拖動，需要設(shè)置在擴(kuò)增曲線接近線性和線與線之間相互平行的位置，即樣本重復(fù)性*的區(qū)域，通常是在指數(shù)擴(kuò)增期的中期或后期。
- 參比染料
ROX是qPCR實驗中使用的一種參比染料，用于均一化校正儀器的光程差、移液誤差或蒸發(fā)冷凝導(dǎo)致的體積差等，提高結(jié)果的重復(fù)性。ABI的儀器一般都需要在反應(yīng)體系中添加ROX，結(jié)果分析時默認(rèn)的是ROX，如果使用的Master mix里沒有添加ROX，也可以勾選NO ROX分析。但考慮到移液誤差、人為差異在qPCR實驗中的常見性，建議根據(jù)儀器型號添加相應(yīng)濃度的ROX。并且，ROX還可以作為故障分析的依據(jù)，無ROX信號，可以很明確地說明沒有放置Master Mix試劑；ROX信號不規(guī)則變化，說明儀器可能存在故障。
Yeasen生物提供ROX混在Maste mix里面或不同濃度ROX單獨成管的Master mix，兼容各種類型的定量儀器。
讀到這里，你的qPCR儀器使用技能是否已解鎖？想要獲取更多干貨戳下文，下一個熒光定量高手就是你！
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