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雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果不理想？看這里！

熒光素酶（luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的總稱，其中有代表性的是從甲蟲中分離得到的螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶（Renilla luciferase）。由于兩種酶底物和發(fā)光顏色的區(qū)別，且在動物體內(nèi)無內(nèi)源性表達(dá)，使其在雙報告實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用。

1.檢測原理

螢火蟲熒光素酶在氧氣、ATP和鎂離子同時存在的條件下，催化熒光素氧化，生成氧化熒光素，同時產(chǎn)生黃綠色光，波長540-600nm，一般檢測時選用560nm。

海腎熒光素酶只需要氧氣就可以催化腔腸素氧化產(chǎn)生藍(lán)光，波長460-540nm，一般檢測時選用460nm。

不同于綠色熒光蛋白（GFP）需要一定的光激發(fā)才能發(fā)光，且易淬滅；熒光素酶經(jīng)過反應(yīng)本身就可以自發(fā)熒光，并且只有在底物存在時才能發(fā)光。因此GFP只能用于標(biāo)記或檢測反應(yīng)是否發(fā)生，而熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)卻能通過熒光值定量分析熒光素酶的表達(dá)水平。

2.應(yīng)用方向

熒光素酶作為一種理想的報告基因，可用于啟動子研究、miRNA研究、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究等等。

在報告基因的5'端加上待檢測基因的啟動子，就可以用來檢測轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的作用，啟動轉(zhuǎn)錄越多，那報告基因的表達(dá)量就越大，熒光值越高。如果在報告基因的3'端加上目的基因的3'UTR，就能用來檢測miRNA對于目的基因的調(diào)控（抑制作用），報告基因表達(dá)越少，說明miRNA的作用就越強(qiáng)。

一般情況下，海腎熒光素酶基因作為內(nèi)對照使用，將帶有海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞；或是將兩個報告基因構(gòu)建到同一個質(zhì)粒上，分別用不同的啟動子啟動其表達(dá)。計算結(jié)果時，將螢火蟲熒光素酶的檢測值比上海腎熒光素酶檢測值，這樣就可以減少內(nèi)在變化因素對實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響，使測試結(jié)果不受實(shí)驗(yàn)條件變化的干擾。

3.常見問題分析

正是由于報告基因檢測結(jié)果受多種因素影響，如載體狀態(tài)、細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染量、轉(zhuǎn)染效率、裂解效率、加樣精度、檢測過程等，一旦某個細(xì)節(jié)處理不好，都可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或結(jié)果的不準(zhǔn)確。小翊為此精心整理了大家實(shí)驗(yàn)過程中遇到的幾類常見的問題和解決辦法。

1）熒光值過高

熒光值過高可能會超出儀器檢測范圍，從而檢測不到值，一般讀數(shù)在5-6位之間較好。熒光值過高可通過以下方式嘗試解決：

A.減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量；

B.細(xì)胞樣品裂解后，離心取上清后檢測或?qū)α呀猱a(chǎn)物進(jìn)行稀釋后檢測。

注：不建議通過減少底物量來降低熒光值，需要保證底物的飽和來反映熒光素酶真實(shí)的表達(dá)水平，否則會造成檢測結(jié)果出現(xiàn)大的偏差。

2）熒光值過低或無熒光值

熒光素酶的表達(dá)水平與啟動子活性相關(guān)，正常表達(dá)水平下檢測到的熒光值應(yīng)在10⁵數(shù)量級左右，若檢測到的熒光值比較低或無熒光值，可從啟動子活性、轉(zhuǎn)染效率、檢測過程這幾方面進(jìn)行考慮：

• 轉(zhuǎn)染效率低

A.優(yōu)化轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)條件，用較易轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒做陽性對照（如轉(zhuǎn)染過表達(dá)熒光蛋白質(zhì)粒）；

B.確保轉(zhuǎn)染DNA的質(zhì)量，可通過酶切或瓊脂糖凝膠電泳的方法對DNA質(zhì)量進(jìn)行鑒定；

C.選擇活性較高，處于指數(shù)分裂期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

• 啟動子活性低或誘導(dǎo)失敗

A.轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)使用特異性誘導(dǎo)啟動子的條件；

B.優(yōu)化細(xì)胞的培養(yǎng)條件，提高熒光素酶的表達(dá)量；

C.更換強(qiáng)啟動子（如SV40、CMV）。

注：海腎熒光素酶基因作為內(nèi)對照，其表達(dá)應(yīng)不受時期、部位、環(huán)境影響，因此常用組成型表達(dá)的TK啟動子。

• 樣品裂解效率低

A.細(xì)胞培養(yǎng)時間不宜過長，12-36h內(nèi)醉好，長時間培養(yǎng)后，細(xì)胞可能會難裂解；

B.加入的裂解液需足量，保證細(xì)胞能夠充分裂解。

• 檢測過程操作不規(guī)范

A.選擇合適的檢測儀器，能夠檢測化學(xué)發(fā)光或者生物發(fā)光的儀器都適用于該實(shí)驗(yàn)；

B.需加入足量底物，保證底物的飽和，否則會造成檢測結(jié)果出現(xiàn)很大偏差；

C.室溫反應(yīng)。反應(yīng)時各個組分（細(xì)胞裂解產(chǎn)物，底物工作液等）都需要調(diào)整到室溫；

D.熒光素酶的半衰期一般約30min，加完底物后可立即檢測，盡量在30min內(nèi)完成。

• 底物氧化失效

A.底物避光密封保存，螢火蟲熒光素酶底物-20℃保存；海腎熒光素酶底物推薦-80℃保存；

B.反應(yīng)工作液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。

3）復(fù)孔重復(fù)性差

報告基因檢測實(shí)驗(yàn)受多種因素影響，因此同批次樣品檢測值也可能出現(xiàn)浮動。除了引入另一個報告基因作為內(nèi)參照避免實(shí)驗(yàn)條件變化的干擾之外，一般還需設(shè)置3個或3個以上復(fù)孔。想要得到一個準(zhǔn)確的結(jié)果，應(yīng)盡可能減小復(fù)孔之間的差異性：

A.細(xì)胞裂解后建議離心取上清，保證樣本的均一性；

B.保證加樣的準(zhǔn)確性，移液器需定期校準(zhǔn)，確保移液；

注：熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)的檢測結(jié)果非常靈敏，復(fù)孔之間的數(shù)值有一定差異是正常的，一般認(rèn)為在同一個數(shù)量級的差異是可以接受的。

以上就是大家平常給小翊反饋多的幾個問題，讀完此文大家是否對這個實(shí)驗(yàn)有了更深一步的認(rèn)識？如果您在實(shí)驗(yàn)中還遇到其他問題，歡迎留言或電話咨詢。下面是福利時間！

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