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揭秘各種主流二代測序儀，無瓜攻略

隨著基因領域研究的不斷深入，自sanger測序?qū)崿F(xiàn)對堿基信息的可讀取后，更高通量的需求使得二代測序在基因組測序、臨床檢測和生物制藥等領域展現(xiàn)出的潛力。

對于剛?cè)胄械男』锇?，面對各式各樣的測試平臺好奇又迷茫，Roche454、Illumina、Thermo Fisher，以及國產(chǎn)MGI平臺等，這么多測序儀，他們的特點是什么？背后的發(fā)展歷程是怎樣的？

今天小翊借花獻佛，梳理了目前主流的二代測序平臺，讓我們了解二代測序這十幾年的發(fā)展歷程。

表1二代測序部分儀器展示

備注：圖片來源于各儀器品牌關網(wǎng)和網(wǎng)絡

羅氏454 GS測序系統(tǒng)——昔日的輝煌

二代測序于2005年初登舞臺，454公司基于焦磷酸測序法推出了Genome Sequencer 20 System(GS 20)系統(tǒng)，開啟了邊合成邊測序（sequencing-by-synthesis）高通量測序的進程。2007年，羅氏公司收購了454，并推出了一系列性能更優(yōu)的NGS系統(tǒng)，極大的提升測序通量和準確性，也進一步增加了測序讀長。雖然羅氏454具有讀長優(yōu)勢，但是測序通量和成本始終限制了454平臺的推廣，因此羅氏在2016年底終止了454 NGS測序相關的業(yè)務。

表2羅氏454 GS測序儀器參數(shù)對比

備注：數(shù)據(jù)來源于羅氏關網(wǎng)和網(wǎng)絡

二、Illumina測序儀——測序界的巨鱷

2006年，Solexa公司推出了Genome Analyzer系統(tǒng)（簡稱GA），其包括DNA簇（DNA cluster）、橋式PCR（Bridge PCR）和可逆阻斷（Reversible terminator）等核心技術，這使得GA系統(tǒng)在高通量、低成本、應用范圍廣等方面具有明顯優(yōu)點。2007年，Illumina公司收購了Solexa，并在隨后幾年間發(fā)布了多種測序儀，主要包括兩類：低通量的桌面式測序儀和高通量臺式測序儀，基本覆蓋行業(yè)內(nèi)的各種測序應用，目前占據(jù)的測序*超8成。

1、Illumina HiSeq系列

  HiSeq系列由Illumina公司2010年推出，該系列非常適合全基因組、轉(zhuǎn)錄組測序。2014年1月，Illumina宣布推出HiSeq X Ten測序平臺，適用于大規(guī)模人群分析，包括10個可平行測序的超高通量測序儀，此系統(tǒng)號稱為第-個將人類全基因組測序成本降至1000美元或更低的測序平臺。

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測序原理：利用可逆性末端邊合成邊測序技術、四通道成像技術，每輪測序反應中存在4種核苷酸。

儀器特點：該系列儀器成本低，靈活性高，通量大。缺點是讀長短和對每個測序反應產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)的存儲和分析系統(tǒng)不足。

應用領域：Hiseq2500適合大規(guī)?；蚪M學，Hiseq3000/4000適合生產(chǎn)級模板的基因組學，Hiseq X Five適合生產(chǎn)級規(guī)模的人類全基因組測序，Hiseq X Ten適合群體規(guī)模的測序?？傮w來說，Hiseq系列適合全基因組測序、靶向重測序、全轉(zhuǎn)錄組測序、de novo測序、表觀遺傳調(diào)控等。

2、Illumina MiSeq

    MiSeq系列由Illumina公司2011年推出，與Hiseq分享主要的核心技術，但是體積和通量更小、價格低，Miseq更佳便于擴增子和細菌樣本測序，更佳適合臨床使用。

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測序原理：可逆性末端邊合成邊測序技術、四通道成像技術。

儀器特點：易于操作，體積小巧，可進行雙向擴增子測序，樣本制備簡易，具有2x300 bp的讀長，實現(xiàn)高達15 Gb的產(chǎn)出。缺點是不適合WGS和WES測序。

應用領域：MiSeq系列快速簡約，適合小型全基因組測序（微生物、病毒）、靶向基因測序（擴增子、基因集合）、16S宏基因組測序、靶向基因表達譜、長片段擴增子測序、DNA-蛋白互作分析及miRNA和小RNA分析等。

3、Illumina Nextseq 500

Nextseq 500是Illumina公司于2014年推出的一款高通量臺式測序儀，其大小與Miseq相當，性能卻與Hiseq相當。

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測序原理：改良型邊合成邊測序（兩通道SBS）化學原理。

儀器特點：運行時間短、測序質(zhì)量高，全基因組、外顯子和RNA測序可在一個平臺完成，改良型技術效率更高。

應用領域：適合大型全基因組測序（人類、植物、動物）、小型全基因組測序（微生物、病毒）、外顯子組測序、靶向基因測序（擴增子、基因集合）、全轉(zhuǎn)錄組測序、基因表達譜（mRNA-Seq）、miRNA和小RNA分析、DNA-蛋白互作分析、甲基化測序和16S宏基因組測序。

4、Illumina MiniSeq

MiniSeq 是Illumina公司于2016年1月發(fā)布的一款小型桌面式測序儀，體積比Miseq儀器小44%。

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測序原理：可逆性末端邊合成邊測序技術、雙通道成像技術。

儀器特點：運行時間短、選擇靈活，測序質(zhì)量更高。缺點是不適合WGS和WES測序。

應用領域：適合大型全基因組測序（人類、植物、動物）、小型全基因組測序（微生物、病毒）、外顯子組測序、靶向基因測序（擴增子、基因集合）、全轉(zhuǎn)錄組測序、基因表達譜（mRNA-Seq）、miRNA和小RNA分析、DNA-蛋白互作分析、甲基化測序和16S宏基因組測序。

5、Illumina NovaSeq系列

NovaSeq系列是Illumina公司于2017年1月發(fā)布的可擴展的高通量測序儀，該系列有5000和6000兩種系統(tǒng)，并且具有可選擇的不同數(shù)量流動槽芯片的測序模式。

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測序原理：可逆性末端邊合成邊測序技術、整合了圖案化流動槽技術。

儀器特點：可擴展、通量高、選擇靈活、簇密度和產(chǎn)出更高。

應用領域：使用范圍廣，以上4種類型儀器的測序領域均可覆蓋。

Illumian公司系列測序儀參數(shù)對比如表3所示：

表3 Illumina測序儀器參數(shù)對比

備注：數(shù)據(jù)來源于Illumina關網(wǎng)

三、Thermo Fisher體系測序儀——測序的聯(lián)合王國

2008年ABI與Invitrogen合并成為Life technologies公司，2010年8月，Life Technologies將Ion Torrent收購，2013年，Life Technologies被Thermo Fisher收購，借此Thermo Fisher正式入駐測序行業(yè)，旗下測序體系包括ABI SOLID和Ion-Proton兩種平臺。

1、ABI SOLID

ABI在收購了Agencourt Personal Genomics測序公司后，推出了SOLiD™ 5500和SOLiD™ 5500xl新一代測序儀，為廣大科研工作者提供更為全面的NGS服務解決方案。

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測序原理：微乳滴PCR與微球相結(jié)合的策略來擴增DNA模板，并在測序過程中對堿基間隔反復的讀取，拼接合成后終獲得整條模板片段的完整序列信息。

儀器特點：測序通量已達到45Gb/天，準確率高達99.99%。并且SOLiD系統(tǒng)對于高GC含量的樣本，也具有非常大的優(yōu)勢。缺點是讀長較短，測序時間長。

應用領域：全基因組測序、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）、微生物測序、數(shù)字核型分析、臨床測序、基因型分析、基因表達分析和小分子RNA的發(fā)現(xiàn)等等。

2、Ion PGM

Life Technologies公司于2010年推出了半導體個人化操作基因組測序儀Ion PGM™，主要用于小基因組和外顯子的測序。

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測序原理：基于離子半導體測序技術，檢測堿基摻入過程中釋放氫離子，不用熒光、化學發(fā)光和酶級聯(lián)反應，通過高敏的離子傳感器獲得信號數(shù)據(jù)。

儀器特點：樣本消耗少，準確性達到99.97%，提供3種芯片測序，流程簡單。缺點是讀長短，不利于基因組de nova組裝，并且對于單堿基重復序列準確率不高。

應用領域：小基因組測序（如微生物和病毒的從頭測序和重測序，線粒體測序等）、擴增子重測序（16S宏基因組測序）、靶基因組測序、基因組/全外顯子驗證等。

3、Ion Proton

Life Technologies公司于2012年宣布在中國推出新的臺式基因測序儀Ion Proton system，旨在一天內(nèi)完成人類基因組測序。Ion Proton™測序儀采用了新一代半導體測序技術，且芯片密度比Ion PGM™測序儀高1000倍，運行速度更快，單位時間的通量更高。

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測序原理：離子半導體測序技術。

儀器特點：測序時長更短，兩種通量芯片可供選擇，單次可產(chǎn)生10-15Gb數(shù)據(jù)量，支持條形碼讀取并完成單片96個樣本的測序。缺點是原始數(shù)據(jù)準確性相對不高，讀長較多，平均大讀長為200bp。

應用領域：適用于外顯子（構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因片段）測序，以及人類或植物基因組圖譜繪制等大型測序工程。

4、Ion S5/S5xl

2015年10月推出了Ion S5和IonS5 xl，適用于靶向測序。該系統(tǒng)將多個gene panel和小的基因組集合起來，并簡化操作流程和動手在操作時間，目前支持4種不同的芯片類型。

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測序原理：離子半導體測序技術。

儀器特點：運行速度更快，需要樣本少，不同通量的芯片可選。缺點是讀長較短，數(shù)據(jù)分析工具和途徑較少。

應用領域：可應用于癌癥、遺傳病、液體活檢、感染性疾病領域。使用于靶向RNA和DNA測序，微生物、轉(zhuǎn)錄組、外顯子組和RNA-seq。

Thermo Fisher體系測序儀參數(shù)對比如表4所示：

表4 Thermo Fisher體系測序儀器參數(shù)對比

備注：數(shù)據(jù)來源于Thermo Fisher關網(wǎng)和網(wǎng)絡

四、華大智造測序儀——測序?qū)玫男沦F

2013年3月18日，華大基因?qū)G(Complete Genomics)公司全額收購，開啟了華大測序儀之路。歷經(jīng)兩年的研發(fā)和改進，華大基因推出了BGISEQ-500桌面化測序系統(tǒng)。之后又推出的BGISEQ-50、MGISEQ-200和MGISEQ-2000均取得了CFDA認證，還推出了MGISEQ-T7，華大測序體系得到了從8G到6T通量的覆蓋，應用領域也得到了極大的拓展。

1、Revolocity

2015年6月推出了一款*集成式的“超級測序儀”——Revolocity測序儀，該系統(tǒng)一年可完成10000-30000個全基因組測序，也支持全外顯子測序。

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測序原理：cPAL技術。

儀器特點：適用于大規(guī)模WGS和WES，50ⅹ深度基因組測序僅需8天，50ⅹ深度下對人類基因組測序拷貝數(shù)變異和結(jié)構(gòu)變異為96%，模塊化處理全血和唾液用時少。缺點是目前于人類全基因組測序。

應用領域：全基因組測序和全外顯子測序。

2、BGISEQ-500

2015年華大基因推出了新型桌面化測序系統(tǒng)BGISEQ-500。

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測序原理：以cPAL技術和改進的DNA納米球技術為核心技術。

儀器特點：85%以上的數(shù)據(jù)高于Q30標準，多讀長選擇，雙芯片平臺，全自動文庫制備系統(tǒng)和全自動樣本加載系統(tǒng)，目前應用于中國大陸地區(qū)。

應用領域：NIPT、PGS、PM-Seq、染色體異常檢測、WGS、WES、RNA-seq（定量）、轉(zhuǎn)錄組測序、ChIP-Seq、small RNA等。

華大智造測序儀參數(shù)對比如表5所示：

表5 華大智造測序儀器參數(shù)對比

五、小結(jié)

羅氏454則在長讀長、低通量和高精度需求領域還有少許應用。雖然羅氏454在二代測序儀名落孫山，但是并未放棄，其在臨床檢測領域也做出了許多的努力。

華大測序儀作為后起新秀，在不斷布局，覆蓋各種通量和測序領域，由于其成本相對較低，并且具有本土優(yōu)勢，市場較為看好。如果能夠在敏感性與特異性之間做到平衡優(yōu)化就更好了。

Thermo Fisher旗下的多種測序儀雖然市場占有相對較小，但是其主要服務的臨床檢測行業(yè)的市場前景還是非常向好的。如果能解決Ion Torrent平臺的傳感器在測量同一堿基連續(xù)出現(xiàn)時所產(chǎn)生的誤差也勢必會吸引更多的客戶。

總體而言，目前市場的占有還是Illumina公司，其測序平臺之間具有高度互補性與交叉性，使得其在短讀長測序上大占優(yōu)勢，但是在讀取那些高AT或高GC富集的片段的時候錯誤率差強人意。并且隨著臨床診斷的興起，Illumina也面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

六、測序儀選擇

以上，小翊給大家介紹了二代測序儀的基本情況，那怎么樣才能選擇一款合適的測序儀呢？其實二代測序儀選擇主要基于儀器性能指標和臨床需要。總體來說，臨床實驗室需要多種用途、性能穩(wěn)定、性價比高和具有便于操作者試用的生物信息學工具的測序儀?？梢跃C合考慮以下幾個方面進行選擇：

參考文獻：李金明，高通量測序技術，2018，科學出版社。