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活死細(xì)菌、細(xì)胞檢測
-----探尋生命的奧秘
背景介紹
真核生物（哺乳動物細(xì)胞）和原核生物（細(xì)菌）細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡間平衡對維持細(xì)胞有機(jī)的發(fā)育與生命的維持至關(guān)重要，如果出現(xiàn)失衡將導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。活死狀態(tài)是研究生物增殖生長的常見研究目的，例如；對于真核活死細(xì)胞主要通過分析細(xì)胞質(zhì)膜完整性與細(xì)胞內(nèi)酯酶活性，經(jīng)過特定儀器觀察判斷，為研究細(xì)胞狀態(tài)提供了一種方便的方法，同時(shí)分析活細(xì)胞與死細(xì)胞，用于評估細(xì)胞的活力。可以應(yīng)用于大多數(shù)的真核哺乳動物細(xì)胞，但不適用于真菌和酵母。主要對于藥物研究、毒性判定、細(xì)胞生長狀態(tài)研究等。
翊圣生物經(jīng)過匠心研發(fā)提供針對真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的雙染檢測試劑盒，滿足您的研究所需。
檢測原理
一、 細(xì)胞染色
Calcein-AM是一種常用的對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，發(fā)綠色熒光（Ex=490 nm, Em=515 nm）。 因其在傳統(tǒng)的Calcein（鈣黃綠素）基礎(chǔ)上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團(tuán)，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。一旦進(jìn)入細(xì)胞后Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)并發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。與其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein, AM細(xì)胞毒性極低，適合用于活細(xì)胞染色的熒光探針，而且不會抑制任何的細(xì)胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。
由于死細(xì)胞缺乏酯酶，Calcein-AM僅用于對活細(xì)胞的細(xì)胞生存能力測試和短期標(biāo)記。因此，Calcein-AM常常與死細(xì)胞熒光探針如碘化丙啶（PI）等聯(lián)合使用，同時(shí)進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的熒光雙重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，僅能穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI僅對死細(xì)胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。而用545 nm激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。本試劑盒適用于熒光顯微鏡、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀以及其他熒光檢測系統(tǒng)。
二、細(xì)菌染色
熒光染料DMAO是一種綠色核酸熒光染料，可將活細(xì)菌和死細(xì)菌染色。EthD-III是一種紅色核酸熒光染料，僅能對細(xì)胞膜受損的死細(xì)菌染色。將DMAO和EthD-III混合使用染色時(shí)具有完整細(xì)胞膜的細(xì)菌呈現(xiàn)綠色，而具有受損細(xì)胞膜的細(xì)菌呈現(xiàn)綠色和紅色。結(jié)果可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀來分析，適用于大多數(shù)細(xì)菌類型。
細(xì)菌活力的常見標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)菌在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中繁殖的能力，稱為生長測定。該試劑盒通常與在液體或固體培養(yǎng)基中的生長測定結(jié)果有著很好的一致性。在某些條件下，膜損傷的細(xì)菌可能會在營養(yǎng)培養(yǎng)基中恢復(fù)并繁殖，而這種細(xì)菌在該測定中可能會被認(rèn)為死亡。相反，一些具有完整膜的細(xì)菌可能無法在營養(yǎng)培養(yǎng)基中繁殖，但這些細(xì)菌在該測定中可能被認(rèn)為是活的。因此，如果發(fā)現(xiàn)該檢測和細(xì)菌生長測定之間有相當(dāng)大的差異，應(yīng)該考慮上述的可能性。
應(yīng)用檢測
使用結(jié)果
1、細(xì)胞染色結(jié)果
注：細(xì)胞類型=A375膠質(zhì)瘤細(xì)胞，Calcein-AM=2 μM，PI=4.5 μM，染色時(shí)間=15min
A為Calcein-AM染色圖，B為PI染色圖，C為MERGE圖
2、細(xì)菌染色結(jié)果
注：細(xì)胞類型=大腸桿菌，EthD-III=2 ul，DMAO=4 ul，染色時(shí)間=15min
A為EthD-III染色圖，B為DMAO染色圖，C為MERGE圖
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