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干貨┃TaqMan qPCR實(shí)驗(yàn)?zāi)辽傩枰私膺@些！
提到實(shí)時(shí)熒光定量PCR（簡(jiǎn)稱qPCR），想必大家都很熟悉，它是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光化學(xué)物質(zhì)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行定量分析的方法。根據(jù)所用熒光化學(xué)物質(zhì)的不同，qPCR可分為熒光染料法（SYBR Green Ⅰ法為代表）和熒光探針?lè)ǎ═aqMan法為代表）。
SYBR Green Ⅰ染料法因具有使用簡(jiǎn)便，價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用。但其大的缺點(diǎn)是缺乏特異性，即染料可以與任何dsDNA結(jié)合。因此，qPCR反應(yīng)中有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)會(huì)增加熒光值，影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，而TaqMan探針法的出現(xiàn)解決了染料法非特異性的問(wèn)題。下面，我們一起來(lái)了解一下TaqMan 探針?lè)╭PCR。
TaqMan 探針?lè)╭PCR原理
TaqMan探針?lè)╭PCR是使用TaqMan熒光探針進(jìn)行熒光檢測(cè)的方法。那什么是TaqMan熒光探針呢？它是一段序列特異的、熒光標(biāo)記的寡核苷酸，其5’端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)（Reporter，R），一般為FAM、VIC、HEX、TET等熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)（Quencher，Q），一般為TAMRA、MGB等。
圖：TaqMan 探針圖示。R為報(bào)告熒光基團(tuán)，Q為淬滅熒光基團(tuán)，中間連接的表示核苷酸。
TaqMan探針?lè)╭PCR的原理是在PCR擴(kuò)增時(shí)加入一對(duì)引物的同時(shí)另外加入一條特異性的TaqMan熒光探針，該探針與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。
當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)的空間距離很近，報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)會(huì)被淬滅熒光基團(tuán)吸收，使儀器檢測(cè)不到熒光信號(hào)。
在PCR延伸階段，Taq DNA 聚合酶沿著模板鏈從5’到3’的方向合成新鏈，當(dāng)Taq DNA 聚合酶到達(dá)探針結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，Taq DNA 聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性將探針5’端連接的報(bào)告熒光基團(tuán)切割下來(lái)，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而發(fā)出熒光，切割的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此，通過(guò)檢測(cè)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度可以達(dá)到檢測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。
圖：TaqMan探針?lè)╭PCR原理圖。
TaqMan 探針?lè)╭PCR優(yōu)點(diǎn)與應(yīng)用
1、特異性高、定量準(zhǔn)確
從原理可以看出，熒光探針只與目的序列結(jié)合，理論上探針?lè)ǖ臒晒庑盘?hào)只來(lái)源于目的序列，即不受非特異性產(chǎn)物的影響，因此，TaqMan探針?lè)╭PCR的特異性非常高，定量準(zhǔn)確。
2、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)短
因TaqMan探針法的高特異性，故無(wú)需再設(shè)置熔解曲線檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性如何，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
3、兼容多重反應(yīng)
不同波長(zhǎng)的熒光報(bào)告基團(tuán)可以標(biāo)記不同的探針，因此可以在同一個(gè)反應(yīng)體系中利用不同熒光標(biāo)記的探針同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)，達(dá)到節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本的目的。
正是由于上述優(yōu)點(diǎn)，TaqMan探針法qPCR已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥食品等行業(yè)的基因檢測(cè)，包括疾病的早期診斷、藥物研究、病原微生物檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)等。
圖：TaqMan探針法qPCR的應(yīng)用
TaqMan 探針?lè)╭PCR局限與注意事項(xiàng)
雖然TaqMan探針?lè)ㄓ斜姸鄡?yōu)點(diǎn)，但也有明顯的局限性，如探針合成費(fèi)用較貴，實(shí)驗(yàn)成本較高，探針設(shè)計(jì)難度大等。因此，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前應(yīng)注意以下事項(xiàng)：
1、設(shè)計(jì)引物：引物的GC含量建議在40-60%，Tm值在55-60℃。
2、設(shè)計(jì)探針：
1）探針位置應(yīng)盡可能的靠近上游引物。
2）探針長(zhǎng)度通常在25-35bp，以保證結(jié)合的特異性。
3）探針的Tm值在65-70℃，通常比引物的Tm值高5–10℃，以確保探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度，GC含量在40-60%。
4）探針5'端不應(yīng)含G，因?yàn)?’G能夠淬滅熒光信號(hào)，以避免報(bào)告基團(tuán)的熒光在探針切割后發(fā)生淬滅。
5）報(bào)告熒光基團(tuán)及淬滅熒光基團(tuán)選擇：
①選擇報(bào)告熒光基團(tuán)時(shí)首先要確認(rèn)激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)與儀器是匹配的。對(duì)于多重?zé)晒夥磻?yīng)，標(biāo)記不同探針的報(bào)告基團(tuán)染料的大發(fā)射波長(zhǎng)應(yīng)該至少有15 nm的差異。
②對(duì)于淬滅熒光基團(tuán)，必須要保證其吸收光譜與報(bào)告基團(tuán)的發(fā)射光譜有重合。
常用的報(bào)告熒光基團(tuán)及淬滅熒光基團(tuán)組合見(jiàn)下表：
淬滅熒光基團(tuán) | 報(bào)告熒光基團(tuán) |
BHQ/MGB | FAM、VIC、HEX、TET、JOE、ROX、CY3、CY5等 |
TAMRA | FAM、VIC、HEX、TET、JOE等 |
表：TaqMan報(bào)告熒光基團(tuán)及淬滅熒光基團(tuán)常用組合
6）為確保引物探針的特異性，將設(shè)計(jì)好的序列在blast中核實(shí)一次，若發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)引物探針。
3、確認(rèn)反應(yīng)性能：建議用標(biāo)準(zhǔn)曲線確認(rèn)反應(yīng)的擴(kuò)增效率，根據(jù)*的MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)指南，擴(kuò)增效率需要達(dá)到90%-110%，線性相關(guān)性R2> 0.98。由于探針是TaqMan實(shí)驗(yàn)昂貴的成分，建議先訂購(gòu)引物，用SYBR Green I反應(yīng)來(lái)確定引物的性能之后再訂購(gòu)TaqMan探針。
到這里，本期關(guān)于TaqMan qPCR的內(nèi)容就介紹完了，如果您還有其他問(wèn)題，歡迎下方留言！下面墻裂推薦一波Hieff qPCR系列產(chǎn)品，無(wú)論您是用SYBR Green I 染料法還是 TaqMan探針?lè)ǎ傆幸豢钸m合您哦~！
翊圣TaqMan qPCR產(chǎn)品
應(yīng)用 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) |
反轉(zhuǎn)錄 | Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 |
SYBR Green Ⅰ染料法（通用） | Hifair® qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox ) | 11201ES08 |
Hifair® qPCR SYBR® Green Master Mix (Low Rox Plus) | 11202ES08 | |
Hifair® qPCR SYBR® Green Master Mix (High Rox Plus) | 11203ES08 | |
SYBR GreenⅠ染料法（高靈敏） | Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，No Rox) | 11198ES08 |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，Low Rox) | 11199ES08 | |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，High Rox) | 11200ES08 | |
SYBR GreenⅠ染料法（高特異） | Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，No Rox) | 11195ES08 |
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，Low Rox) | 11196ES08 | |
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，High Rox) | 11197ES08 | |
TaqMan探針?lè)?/span> | Hieff Unicon® qPCR TaqMan Probe Master Mix（單重） | 11205ES08 |
Hieff Unicon® TaqMan multiplex qPCR master mix（多重） | 11208ES08 |
部分高分發(fā)表文獻(xiàn)
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