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小翊教你做雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>
2020-4-8　　閱讀(2980)

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背景介紹

熒光素酶生物檢測技術(shù)誕生于1990年，已有供了更可靠的研究30年的發(fā)展史。單熒光素酶檢測系統(tǒng)到雙熒光素酶檢測系統(tǒng)的發(fā)展，為科研人員提供了更為嚴謹?shù)膶嶒炇侄?。雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在原有的基礎(chǔ)上引入了海腎報告基因，可以排除不同組之間細胞生長狀況、細胞數(shù)目以及轉(zhuǎn)染效率帶來的干擾，起到校正的作用，從而使實驗結(jié)果更為可靠。其發(fā)光原理如下圖1。

圖1 雙熒光素酶發(fā)光原理

實驗方案

將靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5’啟動子區(qū)克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR區(qū)或lncRNA結(jié)合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游，以研究啟動子的強弱和轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的作用或miRNA對目的基因或lncRNA的調(diào)控作用。如圖2.

圖2 報告基因系統(tǒng)用于基因表達調(diào)控研究

實驗應用

1）啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄因子的研究；

2 ) 信號轉(zhuǎn)導通路的研究；

3）蛋白質(zhì)相互作用；

4）miRNA、LncRNA、siRNA等的研究。

。。。

雙報告基因檢測試劑盒多用于動物細胞中，也有相關(guān)科研人員以植物為研究對象。不同的研究對象其操作流程有一定的差異。這里為大家提供細胞、煙草葉片和原生質(zhì)體這三種研究對象對應的操作流程：

一、細胞篇

1、制備重組質(zhì)粒

2、共轉(zhuǎn)染：將Luc/Ren載體和目的基因進行共轉(zhuǎn)染，通常24-48h(選擇轉(zhuǎn)染效率較高的細胞如293T)，載體的轉(zhuǎn)染比例要進行摸索（如1:10、1:20、1:50、1:100），原則上海腎熒光素酶讀值不蓋過主報告基因讀值為好。具體的轉(zhuǎn)染流程參照相關(guān)說明書；

3、細胞裂解處理

a: 對于貼壁細胞，吸盡細胞培養(yǎng)液，按照下表比例加入細胞裂解液，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板使裂

解液*覆蓋細胞；

b: 對于懸浮細胞，離心棄去上清，按照下表比例加入裂解液；

細胞培養(yǎng)板	96孔板	48孔板	24孔板	12孔板	6孔板
裂解液加入量	100μL	150μL	200μL	300μL	500μL

冰上孵育5min，充分裂解細胞。10000-16000rpm離心1min，取上清；

4、熒光檢測（使用含有生物發(fā)光或化學發(fā)光模塊的酶標儀）

取20 μL細胞裂解液，加至黑色酶標板中。加入100 μL 1×螢火蟲熒光素酶反應液，震板混勻，檢測螢火蟲熒光素酶的活力; 加入100 μL 1×海腎熒光素酶反應液，檢測海腎熒光素酶的活力。兩個反應都在30min完成。

5、數(shù)據(jù)分析：實驗結(jié)果為Luc值與Ren值之比。

二、煙草葉片篇

1、制備重組質(zhì)粒

2、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)：質(zhì)粒轉(zhuǎn)化比例需要摸索。轉(zhuǎn)化后需過夜培養(yǎng)，OD600達到0.8以上即可；

3、利用無針頭注射器注射葉片，（先用針頭在葉片上扎個小孔）（注射煙草頂端以下第3-5片葉片）；

4、暗培養(yǎng)1d，光照培養(yǎng)2d;

5、取葉片進行打孔，8mm-1.5cm即可;

6、在2mL的EP管中加入預冷的小鋼珠，放入3-4片煙草葉盤并加入適量的液氮，使用儀器進行研磨破碎（45Hz，30s），加入100μL裂解液，10000-16000rpm離心2min，取上清20μL進行檢測。

7、檢測：方法同動物細胞。

三、原生質(zhì)體篇

1、原生質(zhì)體的制備：不同植物原生質(zhì)體的分離略有差異，請參考相關(guān)文獻；

2、原生質(zhì)體的計數(shù)與活力測定：取少量原生質(zhì)體稀釋液滴加在0.1mm的血球計數(shù)板上，在光學顯微鏡下觀察計數(shù)。用0.01% FDA進行染色，在顯微鏡下對發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體進行計數(shù)。計算原生質(zhì)體的活力。

3、構(gòu)建重組載體；

4、PEG-Ca²⁺介導原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：用MMG溶液重懸原生質(zhì)體。在1.5mL EP管中加入Luc、Ren載體（比例需摸索）、100μL 原生質(zhì)體和110μL PEG4000-Ca²⁺溶液，黑暗處放置20min，加入W5終止反應，離心棄上清，用1mL W1溶液重懸原生質(zhì)體并轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)板中，25℃靜置培養(yǎng)20h；

5、原生質(zhì)體的裂解：將原生質(zhì)體加入2mL離心管中，離心收集原生質(zhì)體，加入100μL左右的裂解液，冰上孵育10min左右。10000-16000rpm離心5min。

6、檢測：取20μL上清至1.5mL EP管中，檢測方法同動物細胞。

FAQ

Q1: 如何選擇海腎報告基因質(zhì)粒？

A1: 盡量選擇中等強度的啟動子，如TK啟動子等，不要選擇強啟動子CMV、SV40等。海腎基因的表達活性應顯著高于背景組，同時不干擾螢火蟲熒光素酶報告基因的表達。

Q2: 如何選擇螢火蟲報告基因質(zhì)粒？

A2：原則上含有l(wèi)uc基因就可以，但是不同實驗所需的載體有一定差異，如研究miRNA、轉(zhuǎn)錄因子的載體是不同的。小翊為大家提供了多種研究轉(zhuǎn)錄因子活性的報告基因載體，可以直接使用，如果您要自己構(gòu)建載體，要注意有些載體沒有啟動子，需要自行插入啟動子，如pGL3 Basic。

Q3: psiCHECK-2的主報告基因是海腎報告基因，而不是螢火蟲報告基因，能用于雙熒光素酶報告基因檢測實驗嗎？

A2：該質(zhì)粒可以用于雙熒光素酶報告基因檢測實驗，本試劑盒的檢測原理是酶和底物的反應，兩種酶經(jīng)裂解處理后都會釋放出來，所以使用該質(zhì)粒不影響檢測實驗。后的數(shù)值為Ren值與Luc值之比。

Q4: 檢測體系可以自行調(diào)整嗎？
A4: 我們推薦20μL裂解液，100μL螢火蟲熒光素酶底物，100μL海腎熒光素酶底物。底物的量可以適當調(diào)整，但是要保證底物是足量的。

Q5: 數(shù)值低，什么原因造成的？

A5: 可能是啟動子活性、轉(zhuǎn)染效率低、裂解不充分、底物失效、操作不規(guī)范等原因造成的，具體的原因需要實驗者進行排查。

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產(chǎn)品名稱	貨號	規(guī)格	價格（元）	*（元）
Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒	11402ES60	100T	1265.00	752.00
Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒	11402ES80	1000T	9965.00	6852.00
Luciferase Reporter Gene Assay Kit 螢火蟲熒光素酶報告基因檢測試劑盒	11401ES60	100T	349.00	/
	11401ES76	500T	969.00	/
	11401ES80	1000T	1748.00	/