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一氣呵成，Hieff Clone攻無不“克”
------克隆新思路，給你好看
Yeasen Hieff CloneTM 一步法克隆試劑盒榮登SCI*期刊:《Cell》《Science》.
詳情點擊：http://www.yeasen。。ｃｏｍ/CompanyNews/1930.htm
http://www.yeasen。。ｃｏｍ/CompanyNews/1951.htm
基于限制性內切酶和T4 DNA連接酶的經典分子克隆技術，易出現假陽性，克隆效率不高。此外，該技術受到多種實驗因素的限制，包括酶切位點的選擇、插入片段制備繁瑣、T4 DNA連接酶序列的偏好性、連接反應時間長等。
提高克隆效率的關鍵，增加配對堿基數
圖1. 幾種克隆方法連接效率的比較
翊圣生物經數年潛心研究，精益求精。摸索與優(yōu)化反復循環(huán)，實現了“末端同源重組技術”由理論到應用的升級，研發(fā)出Hieff CloneTM系列克隆產品。該系列產品克隆效率顯著提升，可達95%以上?；谕粗亟M的方式，該系列產品無需考慮酶切位點，適用于任何載體和任意片段的連接。同時兼具連接反應時間短（20 min）、操作簡單等優(yōu)勢。
非凡匠心，帶來*品質
翊圣生物在成熟的工具酶表達純化平臺基礎上，獲得高純度重組酶，并反復優(yōu)化重組酶反應微環(huán)境，保證Hieff CloneTM克隆試劑盒的*品質。它可以將任意線性化載體和具有與其兩端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。Hieff CloneTM克隆試劑盒簡便、快速、，是無縫克隆的。
產品優(yōu)勢 |
● 無需考慮酶切位點：不受插入片段酶切位點的限制，適用于任何載體；插入片段兼容粘性或平末端。
● 設計簡單：在插入片段的PCR擴增引物5’端引入20 bp左右與載體末端同源的序列即可。
● 快速：50℃，20 min即可完成重組反應?？寺￡栃月士蛇_95%以上。
● 應用廣泛：可用于單片段或多片段定向克隆，也可結合Canace高保真酶，應用于定點突變。
方法對比
方法 | 目的片段制備步驟 | 酶切位點 | 通用性 | 連接時間 | 陽性率 |
一步法同源重組 | 僅需1步 | 不受目的片段限制 | 高 | 20 min | 95%以上 |
傳統酶切酶連 | 需要2步 | 受到目的片段限制 | 低 | 過夜 | 不同基因差別大 |
實驗流程 |
Hieff CloneTM一步法快速定向克隆試劑盒分為單片段克隆和多片段克隆試劑盒，實驗流程見下圖。
圖2：Hieff CloneTM一步法快速定向克隆試劑盒進行單片段和多片段克隆實驗流程圖。
①線性化載體的制備：酶切或PCR制備線性化載體。②插入片段的制備：在目的DNA片段上下游引物的5’端引入20 bp左右載體末端同源序列；PCR反應擴增目的片段。③重組反應：按比例混合線性化載體和目的DNA片段進行重組，50℃反應20 min。④轉化、涂板：將重組產物直接轉化后涂平板。挑取克隆。
產品數據 |
★ 單片段重組
圖3：Hieff CloneTM One Step Cloning Kit可以有效克隆不同長度的單片段基因。
A-D：重組轉化平板。E：插入片段和載體濃度檢測電泳圖。F-H：插入片段PCR鑒定電泳圖。箭頭指示目的條帶。載體：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分別是1.2 kb，3 kb和5 kb，載體與插入片段摩爾比：1:3，重組反應條件：50℃，20 min。
★ 多片段輕松重組
圖4：Hieff CloneTM Plus Multi One Step Cloning Kit進行三片段克隆。
A：重組轉化平板。B：插入片段和載體濃度檢測電泳圖。C：PCR方法鑒定每個單片段和zui終連接基因。箭頭指示目的條帶。載體：pCAMIBA1302，10 kb，三個插入片段長度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，重組反應條件：50℃，20 min。
★ 載體與插入片段摩爾比1:3左右zui適
圖5：Hieff CloneTM One Step Cloning Kit進行單片段和載體不同摩爾濃度比例重組克隆測試。
A-C：重組轉化平板。載體與插入片段的分子摩爾數比分別是1:2（A），1:3（B）和1:4（C），重組反應條件：50℃，20 min。
★ 重組反應時間20-30 min*
圖6：Hieff CloneTM One Step Cloning Kit進行不同重組反應時間克隆測試。
A-C：重組轉化平板。重組反應時間分別是20 min（A），25 min（B）和30 min（C），重組反應溫度：50℃。
客戶體驗專區(qū) |
- 率重組
實驗信息：載體大?。?/span>10217 bp；目的片段大小：2352 bp。
圖7：使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit進行克隆，克隆陽性率100%。
A：陰性對照轉化平板。B：重組質粒轉化平板。C：1和2分別為原始載體和線性化載體濃度檢測電泳圖。D：目的片段的濃度檢測電泳圖。E：目的片段的菌落PCR鑒定電泳圖。F：1為重組質粒的酶切鑒定電泳圖，2為原始質粒酶切對照圖。M：DL10000. (南京農業(yè)大學)
- 長片段重組
實驗信息：載體大?。?000 bp，目的片段大?。?500 bp。
實驗數據：
圖8：使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit進行克隆。
A：陰性對照轉化平板。B：重組質粒轉化平板。C：載體和目的片段的濃度檢測電泳圖。D：菌落PCR鑒定電泳圖，箭頭指示目的條帶。 M1：Marker Ⅲ；M2：100 bp DNA ladder。(仁濟醫(yī)院)
- 短片段重組
實驗信息：載體大小：5500 bp；目的片段大小：59 bp。
實驗數據：
圖9：使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit進行克隆。
A：陰性對照轉化平板。B：重組質粒轉化平板。C：載體濃度檢測電泳圖。D：克隆測序對比圖，為陽性結果。M：Trans 2K plus II DNA ladder.(中國農業(yè)科學院)
- 多片段重組
實驗信息：載體大?。?996 bp；四個片段大?。?76 bp，867 bp，915 bp和647 bp。
實驗數據：
圖10：使用Hieff CloneTM Multi One Step Cloning Kit進行克隆。
A：重組質粒轉化平板。B：1為載體酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖。C：菌落PCR驗證結果，其中1為原始質粒對照電泳，2-5為重組質粒，僅檢測863bp的一個目的片段，6為假陽性。D：陽性克隆測序結果。M：Marker II。（微生物所)
◆ 低濃度載體重組
實驗信息：載體大?。?/span> 4700 bp，目的片段大?。?600 bp。
實驗數據：
圖11：使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit進行克隆。
A：重組轉化平板。B：載體濃度檢測電泳圖。C：插入片段濃度檢測電泳圖。D：克隆基因PCR鑒定電泳圖。箭頭指示目的條帶。載體濃度：5 ng/μL，插入片段濃度：25 ng/μL，載體與插入片段摩爾比例為1:2，重組反應條件:50℃，20 min。(西南大學)
高性價比 |
圖12：Hieff CloneTM Plus Multi One Step Cloning Kit與不同品牌的同類產品相比，顯示出更高的性價比
客戶使用情況 |
已得到廣大用戶認可——使用客戶數量600+
主要有：中國科學院上海生命科學研究院，北京大學，中國農業(yè)大學，清華大學生命科學學院，華東理工大學，上海交通大學，復旦大學，華中農業(yè)大學，浙江大學，中國藥科大學，武漢大學，中山大學，東南大學，南京林業(yè)大學，華南農業(yè)大學，南京農業(yè)大學，南方醫(yī)科大學，山西師范大學，中國農業(yè)科學院中國水稻研究所，中國科學院水生生物研究所，暨南大學，中科院健康科學研究所，中國科學院動物研究所，華東師范大學，同濟大學，中國科學院微生物研究所，第二軍醫(yī)大學，上海市東方醫(yī)院，上海植物逆境生物學研究中心，中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院，中國科學院植物研究所，中國科學院南京土壤研究所，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，中國科學院上海有機化學研究所，中國科學院生物物理研究所，中國科學院南海海洋研究所，中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江省農業(yè)科學院等單位的課題組。
常見問答 |
Q：Hieff CloneTM克隆的原理是什么？
A：利用末端同源重組的原理。將任意線性化載體和具有與其兩端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。
Q：與傳統克隆相比，Hieff CloneTM克隆有什么優(yōu)勢？
A：1）無需考慮酶切位點：不受插入片段酶切位點的限制，適用于任何載體；插入片段兼容粘性或平末端。
2）設計簡單：在插入片段的PCR擴增引物5’端引入20 bp左右與載體末端同源的序列即可。
3）快速：50℃，20 min即可完成重組反應?？寺￡栃月士蛇_95%以上。
4）應用廣泛：可用于單片段或多片段定向克隆，也可結合Canace高保真酶，應用于定點突變。
Q：同源序列長度對重組效率的影響？
A：同源序列的長度與克隆數目有相關性，一般同源片段選擇在20 bp左右，可以在15 bp-25 bp范圍內調整。并且選擇盡量避免出現二級結構。
Q：線性化載體和目的片段產物的質量會影響重組反應嗎？
A：線性化載體或目的片段品質較差時會極大影響重組反應，建議割膠回收純化產物。
Q：一步法快速定向克隆試劑盒對感受態(tài)細胞有要求嗎？
A：推薦使用轉化效率為108 cfu/μg的感受態(tài)細胞。如Yeasen的DH5α（cat NO. 11802ES），*0（cat NO. 11801ES）等。
Q：線性化載體和目的片段擴增產物的使用量和比例？
A：載體使用量應大于0.01 pmol，推薦使用量0.03 pmol；克隆載體與目的片段摩爾比應在2:1-1:5范圍內，zui適為1:2-1:3，超過范圍可能會影響克隆效率。
Q：一步法快速定向克隆試劑盒適用實驗有哪些？
A：本試劑盒適用于絕大多數基于常規(guī)“酶切-連接”方法的克隆實驗，并且特別適用于其它常規(guī)方法難以快速實現的基因多點突變、全基因合成等。
Q：多片段一步法快速定向克隆試劑盒可以用于單片段的克隆嗎？
A：多片段一步法克隆試劑盒可以用于單片段的克隆。但是，單片段克隆試劑盒不建議用于多片段的克隆，重組效率可能會受到影響。
Q：一步法快速定向克隆試劑盒反應溫度是50℃，是否可以在37℃進行反應？
A：一般情況下建議在50℃進行反應。50℃有利于消除DNA的二級結構，同時是Hieff CloneTM重組酶的zui適反應溫度。37℃反應條件也可以進行重組反應，請根據實驗需要進行優(yōu)化。
產品發(fā)表文獻 |
1]. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017.（中科院植物生理生態(tài)研究所，王二濤組，IF37.205）
[2]. Xing, Y.H., et al., SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017. 169(4): p. 664-678.e16.（中科院生物化學與細胞生物學研究所，陳玲玲組，IF30.41）
[3]. Zhu T, Zhao Y, Wu Y, et al. The Staphylococcus epidermidis gdpS regulates biofilm formation independently of its protein-coding function[J]. Microb Pathog, 2017,105: 264–271.（IF2.0）
[4]. Li N, Hong T, Li R, et al. Cherry Valley Ducks Mitochondrial Antiviral-Signaling Protein-Mediated Signaling Pathway and Antiviral Activity Research[J]. Front Immunol, 2016,7:377.（IF6.4）
[5].Ma, Y., et al., miR-1908 Overexpression Inhibits Proliferation, Changing Akt Activity and p53 Expression in Hypoxic NSCLC Cells[J]. Oncol Res, 2016. 24(1): p. 9-15.（IF1.74）
[6].Yan, X., et al., The New Synthetic H2S-Releasing SDSS Protects MC3T3-E1 Osteoblasts against H2O2-Induced Apoptosis by Suppressing Oxidative Stress, Inhibiting MAPKs, and Activating the PI3K/Akt Pathway[J]. Front Pharmacol, 2017. 8: p. 07.（IF4.4）
[7].Lu, J., et al., Tiron Inhibits UVB-Induced AP-1 Binding Sites Transcriptional Activation on MMP-1 and MMP-3 Promoters by MAPK Signaling Pathway in Human Dermal Fibroblasts[J]. PLoS One, 2016. 11(8): p. e0159998.（IF2.8）
[8].Wu, R., et al., Direct regulation of the natural competence regulator gene tfoX by cyclic AMP (cAMP) and cAMP receptor protein (CRP) in Vibrios[J]. Sci Rep, 2015. 5: p. 14921.（IF4.25）
[9].He, D.X., et al., A methylation-based regulatory network for microRNA 320a in chemoresistant breast cancer[J]. Mol Pharmacol, 2014. 86(5): p. 536-47.（IF3.92）
[10].Liang, W., et al., Anti-Restriction Protein, KlcAHS, Promotes Dissemination of Carbapenem Resistance[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2017. 7: p. 150.（IF4.3）
[11].Wang, X., et al., Improved PKS gene expression with strong endogenous promoter resulted in geldanamycin yield increase[J]. Biotechnol J, 2017.（IF2.599）
[12]. Li X, Liu C X, Xue W, et al. Coordinated circRNA biogenesis and function with NF90/NF110 in viral infection[J]. Molecular Cell, 2017. (IF 14.7)
[13].Du L, Dong S, Zhang X, et al. Selective oxidation of aliphatic C–H bonds in alkylphenols by a chemomimetic biocatalytic system[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2017: 201702317.（IF9.661）
訂購信息 |
產品名稱 | 產品貨號 | 規(guī)格 | *(元) |
Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit | 10911ES25 | 25 T | 439.00 |
10911ES62 | 5×25 T | 1869.00 | |
Hieff CloneTM Plus Multi one Step Cloning Kit | 10912ES10 | 10 T | 409.00 |
10912ES50 | 5×10 T | 1749.00 |
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10906ES50 | 5×10 T | 1749.00 | |
Hieff CanaceTM High-Fidelity DNA Polymerase | 10135ES60 | 100 U | 626.00 |
10135ES76 | 500 U | 2356.00 | |
10135ES80 | 1000 U | 4256.00 | |
2×Hieff CanaceTM High-Fidelity PCR Master Mix | 10136ES01 | 1 mL | 526.00 |
10136ES03 | 5×1 mL | 1426.00 | |
10136ES08 | 25×1 mL | 5626.00 | |
*0化學感受態(tài)細胞 | 11801ES80 | 10×100 μL | 166.00 |
11801ES92 | 100×100 μL | 1236.00 | |
DH5α化學感受態(tài)細胞 | 11802ES80 | 10×100 μL | 166.00 |
11802ES92 | 100×100 μL | 1236.00 | |
XL10化學感受態(tài)細胞 | 11803ES80 | 10×100 μL | 265.00 |
BL21 (DE3)化學感受態(tài)細胞 | 11804ES80 | 10×100 μL | 280.00 |
JM109化學感受態(tài)細胞 | 11807ES80 | 10×100 μL | 189.00 |
Stbl2 化學感受態(tài)細胞 | 11811ES80 | 10×100 μL | 288.00 |
Ampicillin, Sodium Salt 氨芐青霉素鈉 | 60203ES10 | 10 g | 768.00 |
60203ES60 | 100 g | 968.00 | |
Chloramphenicol, USP Grade 氯霉素，USP級 | 60205ES08 | 5 g | 48.00 |
60205ES25 | 25 g | 1428.00 | |
60205ES60 | 100 g | 208.00 | |
Kanamycin Sulfate 硫酸卡那霉素 | 60206ES10 | 10 g | 169.00 |
60206ES60 | 100 g | 1436.00 | |
Tetracyclin HCl 四環(huán)素鹽酸鹽，USP級 | 60212ES25 | 25 g | 168.00 |
60212ES60 | 100 g | 678.00 |
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