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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述
 

全血直接PCR試劑盒是一款可以直接對全血樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑盒，無需DNA提取或樣品處理，大大降低了污染風(fēng)險(xiǎn)，縮短了檢測時(shí)間。

試劑盒中包含配方優(yōu)化的2× Blood Master Mix，具有很強(qiáng)抑制物耐受性，人血的模板大加入量可達(dá)45%，鼠血的可達(dá)20%，可以靈敏的擴(kuò)增血液樣本中基因組和外源目的DNA篇段。2× Blood Master Mix包含了用于PCR擴(kuò)增除模板和引物外的所有組分，擴(kuò)增產(chǎn)物末端加A，適用于Hieff Clone®快速克隆試劑盒（貨號：10907ES60/10908ES60）。

該試劑盒可用于直接擴(kuò)增的血樣類型包括：新鮮血液、4℃貯存血液、冷凍血液以及儲存在Whatman 903®和FTA®商用卡上的干xue漬，且兼容所有常規(guī)抗凝劑（EDTA、檸檬酸鹽、肝素等）。適用樣本來源包括人血、鼠血、雞血、鳥血、牛血、狗血等。

產(chǎn)品組分
 

a）2× Blood Master Mix：包含Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑、優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑等，產(chǎn)品已混合溴酚藍(lán)染料（不含SDS），PCR產(chǎn)物可以直接進(jìn)行電泳。

運(yùn)輸和保存方法
 

冰袋運(yùn)輸。-20℃保存。避免反復(fù)凍融。

操作方法
 

1. PCR反應(yīng)體系配制
 

【注】：使用前務(wù)必充分混勻，避免劇烈震蕩產(chǎn)生過多氣泡。
 a）模板使用量：進(jìn)行基因組上的目的片段檢測，建議使用少量的血液量作為模板；檢測血液樣本中某種病毒或細(xì)菌等的目的片段，建議擴(kuò)大PCR體系并使用較大量的血液模板。血液模板多占PCR體系的45%（人血）、20%（鼠血）。若模板使用含有血液的采集卡，可截取直徑1-4 mm的血點(diǎn)，直接加入20-50 μL PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。

b）引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據(jù)情況在0.1-0.5 μM之間進(jìn)行調(diào)整。

c）反應(yīng)體系：推薦使用20 μL或 50 μL，以保證目的基因擴(kuò)增的有效性和重復(fù)性。

d）體系配制：配制好PCR反應(yīng)體系，置于渦旋儀上渦旋混勻，瞬時(shí)離心將反應(yīng)液集于管底。

2. PCR反應(yīng)條件設(shè)置
 

【注】： a）預(yù)變性：95℃，5 min可以讓白細(xì)胞裂解，釋放可用于PCR擴(kuò)增的基因組DNA。請勿縮短時(shí)間或降低溫度。

b）退火溫度：退火溫度設(shè)置為引物Tm值即可。然而，使用高的退火溫度可以有效減少非特異性擴(kuò)增，并提高全血模板的擴(kuò)增效率。因此，如擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較差，可以建立一個(gè)溫度梯度反應(yīng)去尋找引物模板適退火溫度。

c）延伸時(shí)間：按30 sec/kb設(shè)定，如不足30 sec，設(shè)置30 sec即可。

d）擴(kuò)增循環(huán)數(shù)：35個(gè)循環(huán)已可以擴(kuò)增足量產(chǎn)物。太多的循環(huán)將會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加。

3. 擴(kuò)增產(chǎn)物分析
 

PCR完成后，建議將反應(yīng)液于1000× g (大約4000 rpm) 離心1～3 min以沉淀血細(xì)胞碎片，之后取上清進(jìn)行下游分析。該步驟可有效去除多種血液組分。當(dāng)使用高濃度血液模板時(shí)此步尤為重要，因?yàn)榻?jīng)過PCR循環(huán)，反應(yīng)管中會存在大量的血細(xì)胞碎片。這些碎片會干擾下游的檢測，如瓊脂糖電泳檢測。注意：由于血液本身的原因，PCR 結(jié)束后在 PCR 管的底部會出現(xiàn)透明凝膠狀物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象。

4. 對照反應(yīng)
 

在PCR結(jié)果分析時(shí)，不管是陽性結(jié)果或陰性結(jié)果，如果沒有對照反應(yīng)，都不能確定結(jié)果是否可靠。為了便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，建議在進(jìn)行PCR時(shí)，設(shè)置陽性和陰性PCR對照反應(yīng)以便于排除假陽性或假陰性的干擾。

4.1 陽性對照反應(yīng)體系
 

【注】：a）模板DNA：選用樣本純化的DNA。

 b）引物的選擇：建議選擇該樣本較易擴(kuò)增的基因的引物，如 β-actin 基因或 GAPDH 等。

4.2 陰性對照
 

PCR反應(yīng)體系被污染會導(dǎo)致PCR結(jié)果出現(xiàn)假陽性，需要設(shè)置陰性對照來排除。將使用的移液器槍頭浸泡在2× Blood Master Mix中，添加引物，ddH2O進(jìn)行PCR擴(kuò)增；另取ddH2O作為模板，用目的基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以排除PCR體系是否被污染和實(shí)驗(yàn)是否有其他污染源。

注意事項(xiàng)
 

1. 盡量使用新鮮抗凝血。若凍存血，應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2. 解凍后2× Blood Master Mix可能出現(xiàn)渾濁，冰上放置1-2 min，待溶液澄清后，上下顛倒混勻，不影響試劑性能。
3. 建議擴(kuò)增片段長度1 kb以內(nèi)，以便擴(kuò)增效率*。

4. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

常見問題與解決方法
 

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HB190220