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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）是一種分子量約為61 kDa的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，能夠催化螢光素（luciferin）氧化成oxyluciferin，在氧化的過程中會發(fā)出波長為560 nm左右的生物螢光。海腎螢光素酶（Renilla luciferase）是一種分子量約為36 kDa的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化腔腸素（coelenterazine）氧化成coelenteramide，在氧化的過程中會發(fā)出波長為480nm左右的生物螢光。兩種生物螢光都可通過化學(xué)發(fā)光儀進行測定。檢測原理如圖所示：

圖1：螢火蟲和海腎螢光素酶檢測原理圖

Dual Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit是一種輝光型雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒，具有高靈敏度和發(fā)光信號穩(wěn)定的特點。本試劑盒中含有高純度的螢火蟲螢光素和腔腸素，在同一個樣品中先以螢火蟲螢光素為底物檢測螢火蟲螢光素酶，后淬滅螢火蟲螢光素酶的螢光信號，并同時以腔腸素為底物檢測海腎螢光素酶，實現(xiàn)雙螢光素酶報告基因檢測。海腎螢光素酶作為內(nèi)參，消除了因孔間細(xì)胞數(shù)量、轉(zhuǎn)染效率不同等造成的影響，使得檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性更高。

相對于閃光型Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit（Cat 11402），本品具有以下優(yōu)點：1）發(fā)光信號更穩(wěn)定性，為實驗設(shè)計提供了更大的靈活性。2）更符合高通量檢測，無需依賴自動進樣器，并且無需棄培養(yǎng)液、離心等步驟，大大的簡化了實驗流程。3）無明顯刺激性氣味。本試劑盒可用于多種常用細(xì)胞培養(yǎng)液：RPMI 1640、DMEM 、MEM-α、F12、DMEM/F12等，其半衰期均為2h左右（22℃），滿足絕大多數(shù)高通量實驗需求。

產(chǎn)品組分

運輸與保存方式

干冰運輸。未拆封試劑盒-20℃保存，有效期1年。

溶解分裝后的D-輝光型螢火蟲和海腎螢光素酶底物于-70℃避光保存1年，或-20℃短期保存不超過1個月。

使用說明

1.需自備的材料

單/多道移液器；不透光細(xì)胞培養(yǎng)白板；化學(xué)發(fā)光儀或帶化學(xué)發(fā)光檢測模塊的酶標(biāo)儀。

2.檢測試劑準(zhǔn)備

1）螢火蟲螢光素酶檢測試劑：使用時將D-輝光型螢火蟲螢光素酶緩沖液一次性全部倒入D-輝光型螢火蟲螢光素酶底物瓶中，充分混勻直至底物*溶解。按使用需求分裝，建議-70℃長期保存或-20℃保存不超過一個月。

2）海腎螢光素酶檢測試劑：根據(jù)實際使用量，以100:1的比例將適量的D-輝光型海腎螢光素酶緩沖液與D-輝光型海腎螢光素酶底物(100×) 混勻，室溫避光備用（例如：如果需要100 mL緩沖液，則需要加入1 mL的底物），建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

注：1）兩種緩沖液都可以4℃，室溫或水浴融化，但溫度不能超過25℃。

2）D-輝光型海腎螢光素酶底物(100×)，每次開蓋前需進行短暫低速離心。

3.操作步驟

1）從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出含哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)板，放置5-15 min，平衡至室溫。

2）螢火蟲螢光素酶活性檢測：

①加入與待測細(xì)胞培養(yǎng)液等體積并平衡至室溫的螢火蟲螢光素酶檢測試劑（例如，96孔板建議加入80 μl培養(yǎng)液，相應(yīng)加入80 μl檢測試劑；384孔板通常加入20 μl培養(yǎng)液，相應(yīng)加入20 μl檢測試劑）。

②在水平搖床上室溫混勻至少10 min。（注：不要用移液器吹吸混勻，產(chǎn)生的氣泡會影響發(fā)光檢測讀數(shù)。）

③在化學(xué)發(fā)光檢測儀或帶化學(xué)發(fā)光模塊的多功能酶標(biāo)儀上檢測螢火蟲螢光素酶發(fā)光信號，加入檢測試劑后2 h內(nèi)完成檢測。

3）海腎螢光素酶活性檢測：

①加入平衡至室溫的海腎螢光素酶檢測試劑，加樣體積與初始細(xì)胞培養(yǎng)液體積相同并充分混勻。（例如，96孔板建議加入80 μl培養(yǎng)液，相應(yīng)加入80 μl檢測試劑；384孔板通常加入20 μl培養(yǎng)液，相應(yīng)加入20 μl檢測試劑）。

②在水平搖床上室溫混勻至少10 min。

③在化學(xué)發(fā)光檢測儀或帶化學(xué)發(fā)光模塊的多功能酶標(biāo)儀上檢測海腎螢光素酶發(fā)光信號，加入檢測試劑后2 h內(nèi)完成檢測。海腎螢光素酶在微孔板上的檢測順序應(yīng)與螢火蟲螢光素酶的檢測順序相同。

4）數(shù)據(jù)分析：

①實驗設(shè)計：根據(jù)不同實驗?zāi)康?，在每個培養(yǎng)板中都應(yīng)設(shè)置空白對照組，實驗組和對照組。

a.空白對照組

背景F：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞+螢火蟲螢光素酶檢測試劑。

背景R：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞+螢火蟲螢光素酶檢測試劑+海腎螢光素酶檢測試劑。

注：用于空白對照組樣品量必須與實驗樣品量相同，并且包含與實驗樣品相同的培養(yǎng)基/血清組合。

b.實驗組：轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)實驗化合物處理(即實驗組F和實驗組R)。

c.對照組：轉(zhuǎn)染細(xì)胞不經(jīng)處理，用以標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果(即對照組F和對照組R)。

②計算結(jié)果：實驗組比值=(實驗組F-背景F）/(實驗組R-背景R)，對照組比值=(對照組F-背景F）/(對照組R-背景R)。

表達倍數(shù)=實驗組比值/對照組比值。

注意事項

1）反應(yīng)溫度：酶促反應(yīng)對溫度較為敏感，加樣檢測前務(wù)必將檢測試劑以及細(xì)胞培養(yǎng)液平衡至室溫（20-25℃）。

2）檢測儀器：能檢測化學(xué)發(fā)光的儀器都適用，但由于不同儀器的設(shè)置和靈敏度不同，測得的光信號值也會不同。

3）檢測板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光細(xì)胞培養(yǎng)白板。

4）檢測設(shè)置：Luminescence，350-700 nm，建議讀板時間設(shè)為0.5-1 sec。

5）發(fā)光信號會受到檢測環(huán)境如培養(yǎng)基組分、溫度等影響，應(yīng)確保同組內(nèi)不同樣本檢測條件一致。

6）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套。

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HB220325