產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff NGS^® DNA&RNA Library Co-Prep Kit for Illumina^®是用于Illumina^®測(cè)序平臺(tái)的DNA&RNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，包含RNA反轉(zhuǎn)錄試劑，常規(guī)dscDNA合成試劑，DNA---片段化試劑，接頭連接試劑，以及文庫(kù)擴(kuò)增試劑。本產(chǎn)品利用專業(yè)開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的新一代片段化酶可以完成DNA和RNA一管式建庫(kù)，簡(jiǎn)化了操作流程，極大的降低了建庫(kù)時(shí)間和成本。本試劑盒具有優(yōu)秀的文庫(kù)轉(zhuǎn)化率，可應(yīng)用于mNGS樣本，腫瘤樣本，復(fù)雜樣本等的建庫(kù)。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，不同GC含量的樣本，均可獲得優(yōu)異的測(cè)序結(jié)果，文庫(kù)覆蓋度高，均一性好，偏好性低，使建庫(kù)變得更加簡(jiǎn)單高效。提供的所有試劑都經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制和功能驗(yàn)證，保證了文庫(kù)構(gòu)建的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)和名稱			12299ES05	12299ES24	12299ES96
12299-A		dT23VN	5 μL	24 μL	96 μL
12299-B		Random Primer	5 μL	24 μL	96 μL
12299-C		1st Reaction Buffer	40 μL	192 μL	768 μL
12299-D		1st Strand Enzyme Mix	10 μL	48 μL	192 μL
12299-E		2nd Reaction Buffer	35 μL	168 μL	672 μL
12299-F		2nd Strand Enzyme Mix	15 μL	72 μL	288 μL
12299-G		Smearase Buffer	50 μL	240 μL	960 μL
12299-H		Smearase Enzyme Mix	25 μL	120 μL	480 μL
12299-I		Ligation Enhancer	150 μL	720 μL	2×1440 μL
12299-J		Novel T4 DNA Ligase	25 μL	120 μL	480 μL
12299-K		2×Super Canace® II High-Fidelity Mix	125 μL	600 μL	2×1200 μL
12299-L		Primer Mix	25 μL	120 μL	480 μL

運(yùn)輸與保存方法

干冰運(yùn)輸。-20℃保存。有效期1年。

注意事項(xiàng)

一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請(qǐng)于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

4. 請(qǐng)使用無(wú)RNase污染的耗材，并對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)域定期進(jìn)行清理，推薦使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。

5. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測(cè)區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；配備文庫(kù)構(gòu)建專用移液器等設(shè)備；定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（推薦使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除噴霧），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

二、關(guān)于接頭連接（Adapter Ligation）

1. 本公司可提供長(zhǎng)接頭（Indexed Adapter）試劑盒和短接頭（也稱為小Y接頭、不完整接頭）試劑盒，客戶可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。

目前有48種Indexed Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）；單端 96種 Index Primers: Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12611~Cat#12612）；雙端 384 種 Index Primers: Hieff NGS® RNA 384 CDI Primer for Illumina® , Set 1~Set 2 （Cat#12414~Cat#12415）。

2. 我們建議選用高質(zhì)量的商業(yè)化接頭。如客戶使用自制接頭，請(qǐng)委托具有NGS引物合成經(jīng)驗(yàn)的公司，并備注需進(jìn)行嚴(yán)格的防污染控制。此外，進(jìn)行接頭退火操作時(shí)，請(qǐng)?jiān)诔瑑襞_(tái)完成。每次只操作一種接頭，防止交叉污染。

3. 使用接頭時(shí)，請(qǐng)?zhí)崆皩⒔宇^取出放在4°C或冰盒上解凍；在室溫操作時(shí)，實(shí)驗(yàn)室溫度最好不要超過(guò)25°C，防止接頭解鏈。

4. 建庫(kù)過(guò)程中，接頭濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致建庫(kù)成功率變低。本試劑盒操作方案中，所加入的接頭體積固定為5 μL，請(qǐng)根據(jù)初始的DNA或者RNA投入量，參考表1，表2對(duì)接頭進(jìn)行稀釋。本公司接頭原始濃度均為15 μM，接頭稀釋液請(qǐng)選擇0.1×TE buffer，稀釋過(guò)的接頭可在4°C保存48小時(shí)。

表1. Input Total RNA量與接頭使用濃度推薦表

表2. Input Total DNA量與接頭使用濃度推薦表

三、關(guān)于文庫(kù)擴(kuò)增（Library Amplification）

1. 本試劑盒中的文庫(kù)擴(kuò)增組分由本公司第二代高保真 DNA 聚合酶所組成，在第一代的基礎(chǔ)上，大大增強(qiáng)了擴(kuò)增的均一性，即使是低拷貝的基因，也能進(jìn)行無(wú)偏好性地?cái)U(kuò)增。

2. 如果您使用 Indexed Adapter（也稱為長(zhǎng)接頭、大 Y 接頭），可使用本試劑盒提供的引物 Primer mix 進(jìn)行擴(kuò)增；如果使用的是“短接頭"或者叫“小 Y 接頭"，則需要使用 Index Primers 進(jìn)行擴(kuò)增，加上相應(yīng)的 Index。

3. 文庫(kù)擴(kuò)增步驟需要嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導(dǎo)致文庫(kù)產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過(guò)多，又將導(dǎo)致文庫(kù)偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴(kuò)增突變積累等多種不良后果。表 3 列舉了使用本試劑盒進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增，Input Total RNA 量與相應(yīng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的推薦。

4. 表3中推薦的循環(huán)數(shù)可滿足絕大多數(shù)建庫(kù)需求，若您的樣本質(zhì)量較差（如降解嚴(yán)重的FFPE樣本），可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)增加循環(huán)數(shù)。

表3. Input Total RNA或者DNA量與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)推薦表*

【注】：*由于文庫(kù)產(chǎn)量不僅與投入量和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)相關(guān)，樣本質(zhì)量等都會(huì)影響產(chǎn)量。建庫(kù)過(guò)程中請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況綜合考慮，選擇最合適的建庫(kù)條件。

四、DNA磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. 建庫(kù)過(guò)程中有多個(gè)步驟需要使用DNA純化磁珠，我們推薦使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進(jìn)行DNA純化和分選。

2. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

4. 轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請(qǐng)勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫(kù)質(zhì)量。

5. 磁珠洗滌使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

6. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無(wú)水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過(guò)分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開(kāi)裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

7. DNA純化或長(zhǎng)度分選產(chǎn)物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產(chǎn)物于4°C可保存2天，-20°C可保存1個(gè)月。

五、關(guān)于文庫(kù)質(zhì)檢（Library Quality Analysis）

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過(guò)長(zhǎng)度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2. 文庫(kù)濃度檢測(cè)可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR絕對(duì)定量的方法。

3. 推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫(kù)濃度檢測(cè)：Qubit^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測(cè)定方法時(shí)，無(wú)法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR絕對(duì)定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫(kù)（即可測(cè)序的文庫(kù)），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測(cè)序文庫(kù)的干擾。

4. 文庫(kù)濃度檢測(cè)不可使用：基于光譜檢測(cè)的方法，如NanoDrop^®等。

5. 文庫(kù)長(zhǎng)度分布檢測(cè)，可通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

六、自備材料（Other Material）

1. DNA純化磁珠：Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Yeasen Cat#12601）或AMPure^® XP Beads（A63880）或其他等效產(chǎn)品。

2. Adapters：含Index的長(zhǎng)接頭（Yeasen Cat#12615~12618）或者無(wú)Index的短接頭試劑盒（Yeasen Cat#12611~12612）。

3. 文庫(kù)質(zhì)檢：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產(chǎn)品；文庫(kù)定量試劑。

4. 其他材料：無(wú)水乙醇、無(wú)菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

建庫(kù)流程圖

 圖1.DNA& RNA共建庫(kù)操作流程

使用方法

Step 1 RNA變性

1. 將 Dt23VN、Random Primer 室溫解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。按照下表配置反應(yīng)液：

表4. RNA預(yù)變性反應(yīng)體系

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表5所示設(shè)置反應(yīng)程序，進(jìn)行RNA的預(yù)變性。

表5.第一鏈cDNA合成反應(yīng)程序

Step 2 第一鏈cDNA的合成（1^st Strand Synthesis）

1. 將第一鏈合成試劑從-20°C取出，室溫解凍，顛倒混勻后瞬離。按表6所示，配制第一鏈cDNA合成的反應(yīng)液。

表6.第一鏈cDNA合成反應(yīng)體系

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表7所示設(shè)置反應(yīng)程序，進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行第二鏈cDNA的合成。

表7.第一鏈cDNA合成反應(yīng)程序

Step 3第二鏈cDNA的合成（2^nd Strand Synthesis）

1. 將第二鏈合成試劑從-20 °C取出，解凍后顛倒混勻；按照表8所示，配制第二鏈cDNA合成反應(yīng)液。

表8.第二鏈cDNA合成反應(yīng)體系

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表9所示設(shè)置反應(yīng)程序，進(jìn)行第二鏈cDNA的合成。

表9.第二鏈cDNA合成反應(yīng)程序

Step 4 DNA---片段化/末端修復(fù)/dA尾添加（DNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing）

該步驟將DNA---片段化，同時(shí)進(jìn)行末端修復(fù)及dA尾添加。

1. 將表10中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于冰上配制表10反應(yīng)體系。

表10. DNA---片段化/末端修復(fù)/dA尾添加 PCR反應(yīng)體系

3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設(shè)置表11所示反應(yīng)程序，進(jìn)行DNA---片段化，末端修復(fù)及dA尾添加反應(yīng)。

表11.DNA---片段化/末端修復(fù)/dA尾添加 PCR反應(yīng)程序

【注】：*DNA---片段化過(guò)程為有效控制片段化效果，避免過(guò)度酶切，反應(yīng)程序可預(yù)先設(shè)置4°C，待模塊溫度降至4°C時(shí)，將PCR管放入PCR儀即可。**對(duì)于完整的基因組DNA，酶切時(shí)間參考表12。

表12.片段化時(shí)間選擇表

 圖2. 不同片段化條件下的文庫(kù)峰形

Step 5 接頭連接（Adapter Ligation）

該步驟可在末端修復(fù)和dA尾添加的產(chǎn)物末端，連接特定的Illumina^®接頭。

1. 參考注意事項(xiàng)二中的表1或表2，根據(jù)Input DNA或RNA量，稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表13中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

3. 于3.3步驟結(jié)束后的PCR管中繼續(xù)配制表13所示反應(yīng)體系。

表13. Adapter Ligation體系

【注】：*Ligation Enhancer使用前請(qǐng)上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時(shí)離心后使用。

**本公司接頭原始濃度為15 μM, 請(qǐng)根據(jù)注意事項(xiàng)二表1或表2的提示，根據(jù)投入量對(duì)接頭進(jìn)行稀釋，使接頭添加體積固定為5 μL。

4. 使用移液器輕輕吹打混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

5. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表14所示反應(yīng)程序，進(jìn)行接頭連接反應(yīng)：

表14. Adapter Ligation反應(yīng)程序

Step6連接產(chǎn)物純化（Post Ligation Clean Up）

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開(kāi)蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過(guò)5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

Step 7 文庫(kù)擴(kuò)增（Library Amplification）

該步驟將對(duì)純化或長(zhǎng)度分選后的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集。

1. 將表15中的試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無(wú)菌PCR管中配制表15所示反應(yīng)體系。

表15.短接頭連接產(chǎn)物PCR反應(yīng)體系

【注】：*如果使用的是無(wú)Index的接頭，俗稱短接頭（小Y接頭），請(qǐng)使用短接頭試劑（Cat#12611~ Cat#12612，Cat#12414~ Cat#12415，）中配備的Index primer進(jìn)行擴(kuò)增。

**如果您使用的是Indexed Adapter（Cat#12615~ Cat#12618），俗稱長(zhǎng)接頭（大Y接頭），可用試劑盒中的Primer Mix進(jìn)行擴(kuò)增；

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表16示反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表16.PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

Step 8 擴(kuò)增產(chǎn)物磁珠純化（Post Amplification Clean Up）

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開(kāi)蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過(guò)5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，進(jìn)行文庫(kù)定量、質(zhì)檢。

Step 9 文庫(kù)質(zhì)量控制

通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過(guò)濃度檢測(cè)和長(zhǎng)度分布檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，具體請(qǐng)參見(jiàn)注意事項(xiàng)五。

HB210701