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20510ESGSTSep Glutathione 4FF Chromatography Column,5ML
| 參考價(jià): | 面議 |
具體成交價(jià)以合同協(xié)議為準(zhǔn)- 20510ES 產(chǎn)品型號(hào)
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
訪問(wèn)次數(shù)：273更新時(shí)間：2025-02-07 13:46:58
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產(chǎn)品簡(jiǎn)介
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,制藥 |
|---|
產(chǎn)品介紹
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF是一種GST標(biāo)簽蛋白純化樹(shù)脂，可以一步純化各種表達(dá)系統(tǒng)中-S-轉(zhuǎn)移酶、依賴(lài)性蛋白和重組衍生物。在結(jié)構(gòu)上，該樹(shù)脂是以高度交聯(lián)的4%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過(guò)12個(gè)原子的間隔臂，用化學(xué)方法共價(jià)結(jié)合還原型制作而成，具有更高的物理化學(xué)特性，可以耐受更高的壓力，在相對(duì)較高的流速下，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的純化，更適于工業(yè)大規(guī)模蛋白的純化。
GSTSep Glutathione 4FF Chromatography Column, 5 mL是裝填了GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF的一種中壓預(yù)裝柱，規(guī)格5 mL，預(yù)裝柱具有標(biāo)準(zhǔn)接口，可以適配商品化的各類(lèi)中壓色譜系統(tǒng)，如?KTA 等，方便客戶操作。
產(chǎn)品信息
貨號(hào) | 20510ES08/20510ES25 |
規(guī)格 | 5 mL /5×5 mL |
產(chǎn)品性質(zhì)
基質(zhì)（Matrix） | 高度交聯(lián)的4%瓊脂糖微球 |
配體（Ligand） | 通過(guò)12原子間隔臂偶聯(lián)的 |
粒徑（Bead size） | 45-165 µm |
載量（Capacity） | >10 mg GST蛋白（40 kDa）/mL基質(zhì) |
最大壓力（PressureMax） | 0.3 MPa，3 bar |
pH穩(wěn)定范圍（pH range） | 3-12 |
儲(chǔ)存緩沖液（Buffer） | 含20%乙醇的1×PBS |
儲(chǔ)存條件
2~8℃保存，有效期2年。
需準(zhǔn)備試劑
所用水和Buffer在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過(guò)濾除菌。
平衡/洗雜緩沖液：140 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.4
洗脫緩沖液：用平衡液配制10 mM 還原型（現(xiàn)配現(xiàn)用）
【注】平衡/洗雜緩沖液或洗脫緩沖液中可加入1-10 mM DTT。
使用說(shuō)明
【注】樣品在上樣前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過(guò)濾，減少雜質(zhì)以防阻塞柱子。
1. 樣品純化（以Akta為例）
1）準(zhǔn)備：將泵管道中注滿去離子水。去掉上塞子，將層析柱連接至色譜系統(tǒng)中。再折斷下口，將預(yù)裝柱接到色譜系統(tǒng)中，并旋緊。
2）清洗：3-5倍柱體積去離子水沖洗層析柱中儲(chǔ)存液。
3）平衡：用5倍柱體積的平衡Buffer平衡層析柱，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護(hù)蛋白的作用。
4）上樣：將樣品加到平衡好的層析柱中，推薦流速1-5 mL/min，保證目的蛋白與樹(shù)脂充分接觸，提高目的蛋白的回收率，收集流出液，待檢測(cè)。
注意：樣品的粘度增加使得即使上樣體積很少，也會(huì)導(dǎo)致層析柱很大的反壓。上樣量不要超過(guò)柱子的結(jié)合能力。大量的樣品體積也可能造成很大的反壓，使得進(jìn)樣器更難使用。
5）洗雜：用10-15倍柱體積的洗雜Buffer進(jìn)行清洗，直到紫外吸收達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的基線，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液，待檢測(cè)。
6）洗脫：用洗脫Buffer 采用一步法或線性梯度洗脫。一步洗脫中，通常5倍柱體積洗脫液足夠?qū)⒛康牡鞍紫疵撓聛?lái)。也可以用一個(gè)小的梯度，例如20倍柱體積或更多，來(lái)分離不同結(jié)合強(qiáng)度的蛋白質(zhì)。
7）清洗與保存：依次使用3倍柱體積的平衡Buffer和5倍柱體積的去離子水平衡填料，最后用5倍柱體積的20%的乙醇平衡，然后保存在等體積的20%乙醇中，置于4℃保存，防止填料被細(xì)菌污染。
2. SDS-PAGE檢測(cè)
將純化過(guò)程中得到的樣品（包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分等）利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)，判定其純化效果。
3. 填料清洗
GST標(biāo)簽蛋白純化產(chǎn)品可以重復(fù)使用而無(wú)需再生，但隨著非特異結(jié)合蛋白的增多和蛋白的聚集，會(huì)造成流速和結(jié)合載量性能下降，此時(shí)需對(duì)填料進(jìn)行清洗。
1）去除一些沉淀或變形物質(zhì)
用2倍柱體積的6 M鹽酸胍溶液進(jìn)行清洗，然后立即用5倍柱體積的PBS，pH 7.4清洗。
2）去除一些疏水性吸附造成的非特異性吸附物質(zhì)
用3-4倍柱體積的70%乙醇或2倍柱體積1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱體積的PBS，pH 7.4清洗。
注意事項(xiàng)
1.請(qǐng)勿冷凍保存本產(chǎn)品。
2.所有操作過(guò)程中，樣本需要在4℃或冰上操作。
3.本產(chǎn)品僅作科研用途。
4. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
附表 問(wèn)題及解決方案
問(wèn)題 | 可能原因 | 推薦解決方案 |
柱子反壓過(guò)高 |
填料被堵塞 | 清洗樹(shù)脂 |
裂解液中含有微小的固體顆粒，建議上樣前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過(guò)濾，或離心去除 | ||
樣品太黏稠 | 樣品中含高濃度的核酸，延長(zhǎng)破碎時(shí)間直至粘度降低，或添加DNaseI （終濃度為5 µg/mL），Mg2+（終濃度1 mM），冰上孵育10-15 min | |
緩沖液太黏稠 | 有機(jī)試劑或蛋白穩(wěn)定試劑（如甘油等）可能會(huì)引起反壓增高，降低操作流速 | |
洗脫組分中無(wú)目的蛋白 | GST標(biāo)簽蛋白變性了 | 使用溫和的裂解條件，實(shí)驗(yàn)條件以經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn) |
過(guò)度的裂解使目的蛋白變性 | ||
目的蛋白聚集產(chǎn)生沉淀 | 在細(xì)胞裂解前溶液中加入DTT，終濃度為1-10 mM | |
融合蛋白改變了GST的構(gòu)象，影響了目的蛋白的結(jié)合力 | 測(cè)定pGEX中GST的結(jié)合力，對(duì)載體進(jìn)行超聲處理，檢測(cè)其結(jié)合力。如果載體中GST有很高的親和力，有可能是改變?nèi)诤系鞍椎臉?gòu)象從而降低了GST標(biāo)簽蛋白的親和力 | |
降低結(jié)合溫度至4℃，充分清洗 | ||
柱子平衡時(shí)間太短，目的蛋白不是在pH 6.5-pH 8.0范圍內(nèi)結(jié)合 | 用pH 6.5-pH 8.0的buffer進(jìn)行充分的平衡，如PBS | |
目的蛋白沒(méi)有洗脫下來(lái) | 洗脫體積太少 | 增加洗脫液體積，減小洗脫流速。 |
洗脫液中濃度太低 | 增加洗脫液中還原型濃度，可嘗試用20-40 mM還原型洗脫。 | |
低pH影響洗脫 | 在不增加洗脫液中量時(shí)，提高洗脫液中pH至pH 8-9會(huì)有改善 | |
增加洗脫液中離子強(qiáng)度，如0.1-0.2 M NaCl | ||
洗脫液被氧化 | 使用新鮮配制的洗脫液 | |
加入DTT | ||
非特異性疏水作用影響目的蛋白的溶解和洗脫 | 洗脫液中加入非離子型洗滌劑，如0.1%的Triton X-100或者2%正辛基-β-D-吡喃葡糖苷Tween-20 | |
電泳或Western Blot檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)多條帶 | Mr 70000蛋白與目的蛋白一起純化下來(lái) | Mr 70000蛋白可能是大腸桿菌基因DnaK的產(chǎn)物，可以在目的蛋白中加入50 mM Tris-HCl，2 mM ATP，10 mM MgSO4，pH 7.4在37℃加熱10min去除 |
可通過(guò)ATP-瓊脂糖膠或離子交換來(lái)去除目的蛋白溶液中的dnaK蛋白 | ||
GST融合蛋白已經(jīng)發(fā)生降解 | 在裂解液中加入蛋白酶抑制劑，如加入1 mM PMSF | |
可能是蛋白酶對(duì)目的蛋白部分降解造成的，可使用蛋白酶缺陷型宿主菌（如lon-或ompT） | ||
細(xì)胞破碎過(guò)度 | 減少細(xì)胞破碎時(shí)間，超聲前加入（菌液體積的0.1倍10 mg/mL，25 mM Tris-HCl，pH 8.0），避免發(fā)泡導(dǎo)致蛋白酶變性，過(guò)度超聲破碎增加宿主內(nèi)源蛋白與GST融合目的蛋白的共純化。 | |
共價(jià)共純化 | 包括促進(jìn)蛋白正確折疊的分子伴侶的共純化，如：DnaK（Mr～70000），DnaJ（Mr～37000），GrpE（Mr～40000），GroEL（Mr～57000），GroES（Mr～10000） | |
抗體與E. coli的各種蛋 白反應(yīng) | 抗體吸附E. coli蛋白：GST-抗體；超聲處理去除GST抗體，可以用Western Blot檢測(cè) |
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