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HMGB(高遷移率族蛋白B1) zui近被認為是內(nèi)毒素的晚期致命因子介質(zhì)，并被普遍認為是一種炎癥介質(zhì)，在急性的臨床炎癥疾病中起到至關(guān)重要的作用。

HMGB1 蛋白由216個氨基酸組成， 小鼠、大鼠、牛、及人99% 的HMGB1氨基酸序列是相同的。HMGB1蛋白由三個結(jié)構(gòu)域組成。分別為“A Box (氨基酸序列：9-85)”、B box(氨基酸序列：88-162)和一個帶負電荷的羧基端（氨基酸序列：186-216）。此外，B-box 參與炎癥反應(yīng)活性而A Box 則被認為是作為一個拮抗劑的功能。

許多證據(jù)表明HMGB在炎癥反應(yīng)免疫應(yīng)答中發(fā)揮的重要性。例如，已有研究表明，HMGB可以有許多細胞主動分泌，例如：巨噬細胞被LPS ,TNF 和IL-1 刺激后，主動分泌HMGB1蛋白，也可由壞死細胞被動釋放。事實上，感染性休克死亡的病人血清中的HMGB1蛋白水平高于敗血癥病人。同樣，在敗血癥動物模型及膠原誘導的關(guān)節(jié)炎模型血清中，也可檢測到高水平的HMGB蛋白。關(guān)于這個蛋白的功能，HMGB1蛋白被認為起到促進細胞釋放TNF和IL-1 細胞因子的功能及與LPS結(jié)合協(xié)同增加外周血單核細胞產(chǎn)生IL-6?？傊?，這些現(xiàn)象表明，HMGB1在炎癥反應(yīng)中起到重要作用。

Chondrex 公司提供捕獲ELISA kit,用于檢測細胞培養(yǎng)上清及小鼠血清中的HMGB1水平。試劑盒包含標準品及足夠的試劑用于檢測40個樣品（復孔）

試劑盒組成

注：

1. 推薦樣品和標準品都進行復孔檢測。
2. 剩于的捕獲抗體、檢測抗體、鏈親和素需儲存于-20°C。
3. 20X的洗液（Wash buffer）低溫儲存會結(jié)晶。如果有結(jié)晶，將Wash buffe 置于水浴中溫育，直至晶體全部溶解。
4. 緩沖液稀釋前用移液器測量的準確體積。（提供足夠的緩沖液）。
5. 該試劑盒可用于檢測 小鼠血清和細胞培養(yǎng)上清中HMGB1蛋白水平。用于分析人的血清HMGB1水平時，應(yīng)特別注意。因為已有研究報道，有自身免疫疾病的病人產(chǎn)生的針對HMGB1的抗體在血清中占9-89%。這些血清中的多抗的存在，封閉了HMGB1抗原表位，從而影響試劑盒中捕獲抗體和檢測抗體對HMGB的結(jié)合。因此，在使用試劑盒之前對病人的疾病背景了解，至關(guān)重要。

操作程序：

1 加入捕獲抗體：將捕獲抗體（100ul）用10ml 溶液A 稀釋后，每孔加入100ul稀釋液，

4℃ 孵育overnight。

2 標準品稀釋液的準備：推薦的標準品濃度梯度為：1.6-100ng/ml。在標準品（1瓶）中加入950ul稀釋液溶液B，則終濃度為100ng/ml。取250ul 100ng/ml稀釋液加入250ul溶液 B,則終濃度為50ng/ml。依次類推，重復5次，依次分別配成25 ng/ml，12.5ng/ul,6.25 ng/ml,

3.1 ng/ml,1.6ng/ml的稀釋液。100ng/ml 的儲存液不能夠在后續(xù)試驗中應(yīng)用。倒掉多余的剩余標準品稀釋液。推薦在每次試驗時用新鮮的標準品稀釋液。

3 樣品稀釋液的準備：4℃1000 rpm離心3min 去除一些不溶物和脂類物質(zhì)，取上清作為試驗樣品。如果HMGB1蛋白水平超過100ng/ml，請配置更高的稀釋度的樣品稀釋液。

4 檢測抗體的準備：用5ml溶液C稀釋檢測抗體（1瓶）

5 洗脫緩沖液的稀釋：用950ml 蒸餾水稀釋50ml 20x洗脫儲存液，配成1x 洗脫液。用1x 洗脫液至少洗版3次（或用自動洗版機）。甩去液體，倒扣板，置干凈的吸水紙上，去除多余的液體。不要讓板子*變干。

 6 加入標準品，樣品和檢測抗體：混勻標準品，檢測樣本和檢測抗體。按圖1，空白孔加入50ul 溶液B，標準品和樣品加到對應(yīng)的孔中。加入50ul 稀釋的檢測抗體到各孔，用移液器（或振蕩儀）上混勻檢測抗體稀釋液和標準品/樣品稀釋液。用封板膜封板，37 ℃孵育1小時，此后4 ℃ overnight。

7 鏈親和素的稀釋：用10ml溶液D稀釋鏈親和素（1瓶）

8 洗滌：用1X 洗滌緩沖液洗板3次（至少）。甩去液體，倒扣板，置干凈的吸水紙上，去除多余的液體。不要讓板子*變干。

9 加入鏈酶親和素：每孔加入100ul 鏈酶親和素稀釋液，室溫孵育30min。孵育時間不要超過1小時。

10 洗滌：用1X 洗滌緩沖液洗板3次（至少）。甩去液體，倒扣板，置干凈的吸水紙上，去除多余的液體。不要讓板子*變干

11 TMB：洗滌后，立即每孔加入100 ul TMB。室溫孵育30min。

12 終止：每孔加入50ul 終止液。

13 讀數(shù)：30分鐘內(nèi)讀取450nm 和 630nm 雙波長OD值。

計算樣品中HMGB1濃度

1 計算空白孔、標準品和樣品的OD平均值。

2 計算標準品和樣品的OD平均值減去空白孔的平均OD值。

3 HMGB1的濃度作為橫坐標，OD的lg值作為縱坐標，做曲線。圖2,示典型的HMGB1濃度從1.6ng/ml 到100ng/ml 標準曲線。