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多重?zé)晒饷庖呓M化Q&A——第一彈
Q：我想要進(jìn)行多色實(shí)驗(yàn)，對(duì)于我的樣本有什么要求嗎？
A：您按照免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)您的樣本進(jìn)行前處理即可。如果是從歷史切片或者蠟塊中挑選用來(lái)做多色，請(qǐng)盡量選取相對(duì)較新的樣本（一個(gè)月內(nèi)），最長(zhǎng)不要選保存超過(guò)半年的樣本，可能會(huì)有靶點(diǎn)缺失或者強(qiáng)非特異性，導(dǎo)致染色效果欠佳。
附上石蠟切片樣本處理推薦：
取新鮮組織（理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm），如取的組織過(guò)大，需要切小后再做固定，以免組織太厚固定液滲透不良，導(dǎo)致后續(xù)染色效果不佳
組織離體后（不要超過(guò)30分鐘）迅速轉(zhuǎn)移到固定液中（一般選用10%中性福爾馬林或4%多聚甲醛），在常溫條件下固定時(shí)間為18-24小時(shí)，不要固定太長(zhǎng)時(shí)間，容易導(dǎo)致組織抗原丟失，影響陽(yáng)性信號(hào)顯色。
浸蠟溫度應(yīng)控制在58~60℃左右，浸蠟用的石蠟應(yīng)經(jīng)常更換，以減少石蠟中二甲苯的含量。高溫下的二甲苯容易使組織發(fā)脆，細(xì)胞收縮，容易導(dǎo)致后續(xù)染色過(guò)程中組織脫片。
切片厚度最佳為4微米，組織太厚容易導(dǎo)致染料滲透不加，且多層細(xì)胞之間熒光發(fā)生串?dāng)_，影響成像觀察。貼片需選用免疫組化專用的防脫載玻片，不要在水浴撈片環(huán)節(jié)添加任何粘合劑，撈片后豎直置于吸水紙上去除水分，輕敲去除水滴，不要用紙擦拭玻片。
切片在45℃~65℃烤箱中烤片30-60分鐘左右，到干片為止，否則后續(xù)染色過(guò)程中易脫片。但需要注意溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)均會(huì)影響抗原的活性，因?yàn)樵诟邷馗稍飾l件下會(huì)加速組織切片中抗原的氧化。
Q：如果我的樣本是冰凍切片或者細(xì)胞爬片，可以用來(lái)做多色實(shí)驗(yàn)嗎？
A：可以的，多色實(shí)驗(yàn)本身不局限您的樣本類型，但需要注意的是您的切片或者爬片能否經(jīng)得起多輪抗體洗脫，在樣本不脫片的情況下，才能有一個(gè)比較好的染色效果。如果您是這類樣本，您需要額外準(zhǔn)備一瓶抗體洗脫液（abs994），替代多色實(shí)驗(yàn)中的熱修復(fù)步驟，采用溫和的洗脫方式，避免高溫高壓破壞切片。需要注意的是，您依舊需要控制切片厚度，盡量保證在單層細(xì)胞的厚度，如太厚，多層細(xì)胞之間發(fā)生重疊，熒光信號(hào)會(huì)發(fā)生串?dāng)_。
（PS：石蠟切片是適合做多色實(shí)驗(yàn)的樣本類型?。?/span>
Q：我該如何選擇用于做多色的抗體呢？
A：多色這項(xiàng)技術(shù)突出的一個(gè)優(yōu)勢(shì)就在于對(duì)一抗種屬?zèng)]有特殊的限定，根據(jù)樣本種屬選擇即可，我們?cè)噭┖斜旧砼鋫淞硕梗ㄊ笸猛ㄓ枚够蛘呖雇枚梗谶x取一抗來(lái)源的時(shí)候，盡可能選擇兔子或者小鼠來(lái)源的一抗，如確實(shí)找不到鼠或兔來(lái)源的一抗也沒(méi)有關(guān)系，您只需要再準(zhǔn)備一個(gè)跟該一抗來(lái)源適配的能用于免疫組化的HRP二抗即可。另外，您的一抗需要能應(yīng)用于IHC，并且盡量選擇單克隆抗體，多抗往往容易產(chǎn)生非特異性。
Q：我注意到你們多色試劑盒中也是熒光染料，我在操作過(guò)程中需要額外避光嗎？
A：不用的，您在常規(guī)日光燈環(huán)境下操作就可以，我們?nèi)玖系臒晒鈴?qiáng)度很高，不會(huì)那么容易淬滅，但涉及到需要孵育或者保存的時(shí)候還是建議您采用避光濕盒進(jìn)行。
Q：我今天做好了多色片子，但無(wú)法立即進(jìn)行掃描觀察，我該怎么保存呢？
A：染好的多色片子可以避光在4℃條件下保存較長(zhǎng)的時(shí)間，但我們建議您完成染色以后，在兩周內(nèi)完成成像，并且如果需要長(zhǎng)時(shí)間保存，建議您用透明指甲油對(duì)蓋玻片邊緣進(jìn)行密封。如保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或保存不當(dāng)，封片劑容易干掉，此時(shí)再成像會(huì)有較強(qiáng)非特異性，可以使用PBS把蓋玻片洗下來(lái)，重新封片以后再觀察，但成像效果依舊會(huì)打折扣，還是建議您盡快完成成像。
（PS：雖然熒光染料沒(méi)有那么容易淬滅，但若多次成像反復(fù)激發(fā)，依舊會(huì)淬滅，2-3次影響不會(huì)很大，但不排除偶然性哦）
Q：整個(gè)多色實(shí)驗(yàn)一般需要多久能夠完成呀？一天能行嗎？
A：如果您的指標(biāo)比較少（2~3個(gè)指標(biāo)），恰好您又是“肝帝"愿意熬夜做實(shí)驗(yàn)，那么一天是可以做完的哦，因?yàn)槲覀兌嗌玖嫌行盘?hào)放大的功能，且試劑盒搭配的二抗是多聚的HRP二抗，也能放大信號(hào)，因此原本需要4℃過(guò)夜的一抗孵育，可以在室溫1小時(shí)，或者37℃烘箱一小時(shí)完成，滿打滿算一天是可以做完實(shí)驗(yàn)的。但如果您不想要這么“肝"，當(dāng)然可以，您只需要在一抗孵育的步驟選擇4℃過(guò)夜，第二天再來(lái)繼續(xù)做二抗孵育等后續(xù)操作就行，跟您做IHC實(shí)驗(yàn)一樣，當(dāng)您指標(biāo)比較多的時(shí)候，可以合理安排，部分抗體室溫1小時(shí)，部分抗體4℃過(guò)夜，但也不可把“戰(zhàn)線"拉得太長(zhǎng)，控制在盡可能短的時(shí)間完成實(shí)驗(yàn)，畢竟遲則生變哦。
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| abs50028 | 四色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（兔二抗） | 20T/100T | 現(xiàn)貨 |
| abs50013 | 五色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（鼠兔二抗） | 20T/100T | 現(xiàn)貨 |
| abs50029 | 五色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（兔二抗） | 20T/100T | 現(xiàn)貨 |
| abs50014 | 六色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（鼠兔二抗） | 20T/100T | 現(xiàn)貨 |
| abs50030 | 六色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（兔二抗） | 20T/100T | 現(xiàn)貨 |
| abs50015 | 七色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（鼠兔二抗） | 20T/100T | 現(xiàn)貨 |
| abs50031 | 七色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（兔二抗） | 20T/100T | 現(xiàn)貨 |
| abs50037 | 七色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（plus）（鼠兔通用二抗） | 20T/100T | 現(xiàn)貨 |
| abs50038 | 七色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（plus）（抗兔二抗） | 20T/100T | 現(xiàn)貨 |
| abs994 | 抗體洗脫液（mIHC專用） | 30ml | 現(xiàn)貨 |
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| 人 | 小鼠 |
| T細(xì)胞：CD3、CD4、CD8、FOXP3、CD45、CD103 | T細(xì)胞：CD3、CD4、CD8、FOXP3、CD45 |
| 巨噬細(xì)胞：CD68、CD163、CD206、CD86 | 中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞：LY6G、CD11c、CD20、CD19 |
| 免疫檢查點(diǎn)：PD-1、PD-L1、HLA-DR、TIM-3、GZMB、CD24、LAG-3 | 巨噬細(xì)胞：F4/80、CD68、CD86、CD11b、CD163、M-CSF |
| 成纖維細(xì)胞：α-SMA | 腫瘤相關(guān)：SHP-2 |
| 腫瘤相關(guān)：Ki-67、PANCK、VEGF | 白介素：IL-4、IL-10、IL-13 |
| NK細(xì)胞：CD56 | 免疫檢查點(diǎn)：GZMB、PD-1、PD-L1 |
| B細(xì)胞：CD20、CD19 | NK細(xì)胞：NKR-P1C（NK1.1） |
| 中性粒細(xì)胞：CD11c | 信號(hào)通路相關(guān)：Arrestin-C、iNOS |
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