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作者：Melanie R. Grably博士

編碼T型CaV離子通道的基因產(chǎn)生三個(gè)成孔亞基：CaV3.1、CaV3.2和CaV3.3，產(chǎn)生的電流在藥理學(xué)和電生理學(xué)上不同于高壓CaV1和CaV2通道電流。由于其重要的生理作用，以及與T型離子通道相關(guān)的通道病的數(shù)量不斷增加，對(duì)特異性和強(qiáng)效藥理學(xué)的需求正在上升。在這篇文章中，我們重點(diǎn)介紹了TTA-A2和TTA-P2的使用，這是阿洛蒙實(shí)驗(yàn)室du家提供的兩種特異性強(qiáng)效T型離子通道阻滯劑。

簡(jiǎn)介

T型CaV離子通道調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性、激素分泌和神經(jīng)遞質(zhì)釋放。它們還在晝夜節(jié)律周期、心血管和腎素-血管緊張素系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。

在小鼠中敲除CaV3.1、CaV3.2或CaV3.3離子通道可產(chǎn)生可行的表型，盡管每種表型都存在各種問(wèn)題。與T型離子通道相關(guān)的通道病包括自閉癥、癲癇、高血壓、高醛固酮癥、慢性疼痛和shen經(jīng)病理性疼痛。由于其重要的生理作用，以及與通道相關(guān)的通道病越來(lái)越多，對(duì)特異性和強(qiáng)效藥理學(xué)的需求正在上升。

TTA-P2

TTA-P2是4-氨甲基-4-氟哌啶的衍生物，shou次被發(fā)現(xiàn)能有效、可逆地阻斷大鼠急性離體DRG的T型離子通道電流，IC50為100 nM，并能使T型離子通道穩(wěn)定在失活狀態(tài)。L型CaV離子通道和NaV通道對(duì)該化合物阻斷作用的敏感性要低100-1000倍。

TTA-P2(#T-155)被用來(lái)深入了解腎上腺小束細(xì)胞中表達(dá)的CaV離子通道的特殊作用和特性。事實(shí)上，TTA-P2抑制了細(xì)胞中表達(dá)的CaV3.2電流（圖1），并抑制了促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和血管緊張素II刺激的皮質(zhì)醇分泌。在缺氧條件下，腎上腺的兒茶酚胺分泌以BDNF/TrkB依賴的方式增加。用Alomone Labs抗TrkB（細(xì)胞外）抗體（#ANT-019）免疫組化染色顯示，TrkB受體在髓質(zhì)中高表達(dá)，其表達(dá)在缺氧條件下增加。除了兒茶酚胺分泌外，TrkB的激活還導(dǎo)致T型CaV電流引起的[Ca2+]增加，應(yīng)用TTA-P2可抑制這種增加，從而顯示了BDNF/TrkB信號(hào)傳導(dǎo)與T型電流之間的聯(lián)系。

圖1.TTA-P2對(duì)AZF細(xì)胞中對(duì)T型CaV離子通道有抑制作用。

A.牛腎上腺束帶（AZF）全細(xì)胞記錄。在用2 μM TTA-P2（#T-155）超滲細(xì)胞之前和之后，在10 mM Ba2+中記錄Ca2+電流對(duì)-5 mV電壓階躍的響應(yīng)，該電壓階躍是從-80 mV的保持電位開(kāi)始施加的。

B.TTA-P2對(duì)CaV3.2電流的濃度依賴性抑制。括號(hào)內(nèi)為測(cè)定次數(shù)的平均值±SE。

經(jīng)美國(guó)生理學(xué)會(huì)許可，改編自參考文獻(xiàn)2。

疼痛的傳遞始于脊髓背角，然后由背角將信息傳遞出去。背角神經(jīng)元超極化后的興奮性去極化反跳是這些細(xì)胞的一個(gè)重要特征，TTA-P2的使用在一定程度上表征了這一特征。數(shù)據(jù)顯示，T型CaV離子通道及其電流的反跳性去極化和點(diǎn)燃對(duì)脊髓的軀體感覺(jué)信息整合非常重要。

丘腦在整合來(lái)自大腦皮層的輸入方面發(fā)揮著重要作用。一旦丘腦接收到這些輸入，就會(huì)將它們送回大腦皮層，形成皮質(zhì)-丘腦-皮質(zhì)環(huán)路。我們對(duì)這些突觸及其對(duì)高級(jí)腦功能的貢獻(xiàn)進(jìn)行了研究。桶狀皮層5B神經(jīng)元和后內(nèi)側(cè)核（POm）的神經(jīng)元被用來(lái)研究丘腦-皮層突觸的形成。利用條件性敲除GluA4、靶向CaV3.1通道的shRNA和T型特異性阻斷劑TTA-P2，數(shù)據(jù)顯示GluA4和CaV3.1控制L5-POm突觸傳遞的重要方面。

TTA-A2

TTA-A2是在鑒定T型特異性強(qiáng)效阻斷劑的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的。該化合物在轉(zhuǎn)染的HEK 293細(xì)胞和原生T型電流上進(jìn)行了表征。數(shù)據(jù)顯示，TTA-A2的IC50值為100 nM，與TTA-P2一樣，它優(yōu)先與處于非活性狀態(tài)的CaV3離子通道結(jié)合。TTA-A2對(duì)CaV3離子通道的選擇性為300倍。在體內(nèi)，TTA-A2能抑制野生型小鼠的主動(dòng)喚醒并促進(jìn)慢波睡眠，但不能抑制缺乏CaV3.1和CaV3.34的小鼠。

血液中的氧含量由頸動(dòng)脈體檢測(cè)。電壓門(mén)控Ca2+通道在檢測(cè)氧氣水平中發(fā)揮重要作用。CaV3.2離子通道是主要的T型CaV離子通道，表達(dá)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是感知氧氣的重要細(xì)胞。事實(shí)上，RT-PCR和使用抗CaV3.2 (CACNA1H)抗體（#ACC-025）的免疫組化顯示CaV3.2在大鼠頸動(dòng)脈體中高表達(dá)。使用相同抗體對(duì)大鼠DRG裂解液進(jìn)行Western印跡分析表明，Ca2+離子通道也在DRG中表達(dá)。重要的是，對(duì)照肽抗原的使用wan全抹去了抗體獲得的信號(hào)。此外，研究發(fā)現(xiàn)CaV3.2參與介導(dǎo)頸動(dòng)脈體對(duì)缺氧的反應(yīng)，應(yīng)用TTA-A2（#T-140）可抑制該反應(yīng)（圖2）。

圖2.TTA-A2抑制T型CaV離子通道對(duì)缺氧的反應(yīng)。

A.在載體或25 μM TTA-A2 (#T-140)存在下以及沖洗后5分鐘，感覺(jué)神經(jīng)對(duì)缺氧反應(yīng)（脈沖（imp）/s）的代表性示例。

B.TTA-A2對(duì)感覺(jué)神經(jīng)缺氧反應(yīng)的影響

經(jīng)美國(guó)生理學(xué)會(huì)許可，改編自參考文獻(xiàn)5。

在大鼠視網(wǎng)膜微循環(huán)的動(dòng)脈血管中研究了T型離子通道在視網(wǎng)膜動(dòng)脈血管肌源性反應(yīng)中的貢獻(xiàn)。使用Anti-CACNA1G (CaV3.1)抗體(#ACC-021)和Anti-CaV3.2 (#ACC-025)抗體對(duì)大鼠視網(wǎng)膜動(dòng)脈血管進(jìn)行免疫組化染色顯示，雖然未檢測(cè)到CaV3.2，但在視網(wǎng)膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的質(zhì)膜上觀察到強(qiáng)烈的CaV3.1染色。在血管周?chē)哪z質(zhì)細(xì)胞端足上檢測(cè)到CaV3.2。應(yīng)用TTA-A2或ML 218（#M-165）可擴(kuò)張離體的肌源性活性視網(wǎng)膜動(dòng)脈血管，證明CaV3.1離子通道在動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞或視網(wǎng)膜動(dòng)脈血管上有功能表達(dá)，并在肌源性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。

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參考文獻(xiàn)

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