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氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量檢測(cè)試劑盒?說(shuō)明書

  可見分光光度法 BC1180 ：50T/48S 試劑一：液體1瓶，50ml，4℃保存。 試劑二：液體1支，170μl，4℃保存。 試劑三：液體1瓶 60ml，4℃保存。
試劑四：液體1瓶 8ml，4℃保存。 試劑五：粉劑1支，4℃保存，用前8ml蒸餾水溶解。 試劑六：液體1支，40μl，用前0.8ml蒸餾水稀釋。 標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑1支，10mg，4℃避光保存。 氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽（GSH）的氧化形式，又稱為二硫代谷胱甘肽，是兩分子的谷胱甘肽氧化而成。GSSG會(huì)被谷胱甘肽還原酶還原成GSH，因此機(jī)體中大多數(shù)是以還原型形式存在。測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能夠很好地反映細(xì)胞所處的氧化還原狀態(tài)。本試劑盒利用谷胱甘肽能和5，5’-二硫代-雙-（2-硝基苯甲酸）（5，5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反應(yīng)產(chǎn)生2-硝基-5-巰基苯甲酸，2-硝基-5-巰基苯甲酸在波長(zhǎng)412nm處具有光吸收的特點(diǎn)，通過(guò)2-乙烯吡啶抑制樣品中原有的還原型谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽還原酶將GSSG還原為GSH，借此測(cè)定氧化型谷胱甘肽的含量。 分析天平、微量勻漿器（規(guī)格2ml）、低溫離心機(jī)、水浴鍋、移液器、可見分光光度計(jì)、1ml比色皿。
一、 樣品的處理
（1）組織處理 新鮮組織先用PBS沖洗2次，然后稱取動(dòng)物組織或者植物組織0.1g。加入用試劑一潤(rùn)洗過(guò)的勻漿器中（勻漿器提前放冰上預(yù)冷）；然后加入1ml試劑一（組織/試劑一比例保持不變即可），迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；10000rpm 4℃離心10min；取上清液放置于4℃待測(cè)，若暫時(shí)不能完成測(cè)試可放于-80℃保存（可保存10天）。 （2）血液處理 血漿：將收集的抗凝血于4℃，600g離心10分鐘，吸取上層血漿到另一支試管中，加入等體積的試劑一，4℃，8000g離心10分鐘，將上清移入新的試管中放置于4℃待測(cè)，若暫時(shí)不能完成測(cè)試可放于-80℃保存（可保存10天）。
血細(xì)胞：將收集的抗凝血于4℃，600g離心10分鐘，棄去上層血漿用3倍體積的PBS清洗3次（用PBS重懸血細(xì)胞，600g離心10分鐘），加入等體積試劑一，混勻后4℃放置10分鐘，8000g離心10分鐘，吸取上清放于4℃待測(cè)，若暫時(shí)不能完成測(cè)試可放于-80℃保存（可保存10天）。 （3）細(xì)胞處理 收集不少于108個(gè)細(xì)胞，先用PBS清洗細(xì)胞2次（PBS重懸細(xì)胞，600g離心10分鐘），加入3倍細(xì)胞沉淀體積的試劑一重懸細(xì)胞，反復(fù)凍融2-3次（可在液氮中凍結(jié)，37℃水浴中溶解），8000g離心10分鐘，收集上清于4℃待測(cè)，若暫時(shí)不能完成測(cè)試可放于-80℃保存（可保存10天）。

二、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)操作：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)412nm，蒸餾水調(diào)零。
2、試劑二放置37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（一般物種）水浴中保溫30min。
3、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：將標(biāo)準(zhǔn)品用1ml蒸餾水溶解(4℃保存)，濃度為10mg/ml。取適當(dāng)溶液配制濃度為25μg/ml、20μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、0μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品（試劑一十倍稀釋后進(jìn)行稀釋）。
4、取1.5ml離心管，加入100μL稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，加入2μL試劑二，混勻后37℃孵育30分鐘。
5、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
孵育完成后標(biāo)準(zhǔn)管依次加入700μL試劑三，100 μL試劑四，100 μL試劑五，10 μL試劑六，迅速混勻后，測(cè)定412nm處30 s和150 s光吸收A1和A2。吸光度（A2-A1）為橫坐標(biāo)（x），濃度為縱坐標(biāo)（y）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6、樣品管依次加入700μL試劑三，100 μL試劑四，100 μL試劑五，10 μL試劑六，迅速混勻后，測(cè)定412nm處30 s和150 s光吸收A1和A2，△A= A2- A1。
三、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量檢測(cè)試劑盒GSSG含量計(jì)算 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品△A帶入公式中（x），計(jì)算出樣品濃度y（μg/ml）。 （1）按蛋白濃度計(jì)算 GSSG（μg / mg prot）=y×V 反總÷V 樣÷Cpr =y×10.12÷Cpr （2）按樣本質(zhì)量計(jì)算 GSSG（μg /g）= y×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)= y×10.12 ÷W （3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算 GSSG（μg /104 cell）= y×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量)= y×10.12 ÷細(xì)胞數(shù)量 （4）按液體體積計(jì)算 GSSG（μg / mL）= y×V 反總÷V 樣= y×10 V 反總：反應(yīng)總體積，1.012mL；V 樣總：上清液總體積，1 mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL=0.1 mL；W：樣品質(zhì)量，g ；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。
1、樣品處理需勻漿*，若當(dāng)天不能完成測(cè)量，可放-80℃保存。
2、若不確定樣品中GSSG含量的高低，可稀釋幾個(gè)梯度后再進(jìn)行測(cè)量。
3、此方法利用酶促反應(yīng)速率計(jì)算底物濃度，盡量準(zhǔn)確在30秒和150秒處完成讀數(shù)。
4、因?yàn)樵噭┮恢泻械鞍踪|(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測(cè)定。