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樣本準(zhǔn)備：血清樣本采集后，需在 1000×g 的條件下離心 10 分鐘，小心分離出血清；血漿樣本同樣按此離心條件處理，注意要依據(jù)不同抗凝劑要求規(guī)范采集，例如使用枸櫞/酸鈉抗凝時(shí)，血液與抗凝劑需嚴(yán)格按照 9:1 的比例混合。細(xì)胞培養(yǎng)上清液則需以 1000×g 離心 10 分鐘，去除其中的細(xì)胞碎片和其他不溶性雜質(zhì)。若樣本不立即使用，應(yīng)分成小份，在 - 20℃或 - 80℃環(huán)境下保存，防止反復(fù)凍融，使用前需在室溫下緩慢充分解凍并確保均勻。
試劑準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒后，需將所有試劑在室溫下平衡 30 - 60 分鐘，使試劑溫度與室溫一致，并充分混勻。同時(shí)，依據(jù)實(shí)驗(yàn)所需檢測(cè)的樣本數(shù)量，確定酶標(biāo)板的使用條數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)品孔和空白孔建議設(shè)置復(fù)孔，以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。此外，要按照說(shuō)明書(shū)要求，用蒸餾水將濃縮洗滌液準(zhǔn)確稀釋成工作洗滌液。
加樣：在酶標(biāo)板上精確設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔與待測(cè)樣本孔。向標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入 50μL 已稀釋好的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度梯度需嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配置；待測(cè)樣本孔加入 50μL 處理好的樣本；空白孔則不加任何試劑。加樣時(shí)，務(wù)必使用微量加樣器，并確保加樣量準(zhǔn)確，將樣本或標(biāo)準(zhǔn)品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量避免觸及孔壁，加樣后輕輕振蕩酶標(biāo)板，使液體充分混勻。
溫育與洗滌：加樣完成后，用封板膜將酶標(biāo)板密封，放置在 37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育相應(yīng)時(shí)間，具體溫育時(shí)長(zhǎng)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。溫育結(jié)束后，小心揭去封板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩 30 - 60 秒后，甩去洗滌液，并用吸水紙拍干，此洗滌操作需重復(fù) 4 - 5 次，以確保充分去除未結(jié)合物質(zhì)。若使用洗板機(jī)進(jìn)行洗滌，需提前按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行設(shè)置，且洗滌次數(shù)應(yīng)適當(dāng)增加 1 - 2 次。
后續(xù)反應(yīng)與檢測(cè)：每孔加入 100μL HRP 標(biāo)記的檢測(cè)抗體，輕輕振蕩混勻，再次用封板膜密封，37℃溫育 30 分鐘。溫育結(jié)束后，重復(fù)上述洗滌步驟。接著，每孔依次加入底物 A、B 各 50μL，輕輕振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡，37℃避光顯色 15 - 20 分鐘。顯色反應(yīng)結(jié)束后，迅速向每孔加入 50μL 終止液，加入終止液后應(yīng)立即使用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的 OD 值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣本中 TFF3 的濃度，若樣本進(jìn)行過(guò)稀釋，還需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)得到實(shí)際濃度。
試劑盒中的所有試劑在使用前必須充分平衡至室溫，避免因溫度差異影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，試劑使用后應(yīng)及時(shí)放回冰箱冷藏保存，防止試劑變質(zhì)。
樣本采集、處理過(guò)程務(wù)必嚴(yán)格遵循規(guī)范操作，防止樣本受到污染或發(fā)生溶血、脂血等情況，以免干擾檢測(cè)結(jié)果。如血清樣本應(yīng)避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)釋放出的具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，可能會(huì)增加以 HRP 為標(biāo)記的 ELISA 測(cè)定中的非特異性顯色。
洗滌過(guò)程至關(guān)重要，既要確保充分去除雜質(zhì)和未結(jié)合物質(zhì)，又要避免過(guò)度洗滌導(dǎo)致已結(jié)合的物質(zhì)脫落。洗滌液的配制應(yīng)準(zhǔn)確無(wú)誤，洗滌次數(shù)和時(shí)間需嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。
加樣操作要精準(zhǔn)、迅速，盡量縮短各孔之間的加樣時(shí)間間隔，保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性。使用加樣器時(shí)，需定期校準(zhǔn)，確保加樣量的準(zhǔn)確性。
顯色反應(yīng)過(guò)程需嚴(yán)格控制時(shí)間和溫度，避免光線直射，以保證顯色效果的穩(wěn)定性。加入終止液后，應(yīng)盡快進(jìn)行 OD 值測(cè)定，一般建議在 15 分鐘以內(nèi)完成，防止結(jié)果出現(xiàn)偏差。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的所有耗材，如酶標(biāo)板、吸頭、試管等，應(yīng)確保無(wú)污染且質(zhì)量可靠，避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。
若對(duì)檢測(cè)結(jié)果存在疑問(wèn)或出現(xiàn)異常情況，應(yīng)及時(shí)檢查實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程、試劑狀態(tài)以及儀器性能等，必要時(shí)可重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。