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苯丙氨酸解氨酶

時間:2018-3-12閱讀:1518
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苯丙氨酸解氨酶(Phenylalnine ammonialyase,PAL)試劑盒                            分光光度法  50管/48樣

注意:正式測定之前選擇 2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

PAL(EC4.  3 1  5)廣泛存在于各種植物和少數(shù)微生物中,是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的

關(guān)鍵酶,與一些重要的次生物質(zhì)如木質(zhì)素、異黃酮類植保素、黃酮類色素等合成密切相關(guān),

在植物正常生長發(fā)育和抵御病菌侵害過程中起重要作用。

測定原理

PAL催化  L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸和氨,反式肉桂酸在 290nm處有zui大吸收值,

通過測定吸光值升高速率計算 PAL活性。

所需的儀器和用品

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1  mL石英比色皿、研缽、冰

和蒸餾水。

試劑的組成和配制

提取液:液體 60mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體 40mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×3 瓶,4℃保存。臨用前每瓶加入 4mL  蒸餾水水充分溶解待用;用不完的試劑 4℃保存;

試劑三:液體 2.5mL×1瓶,4℃保存。

粗酶液提取

按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL

提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

測定步驟

試劑名稱(μL)

測定管

對照管

樣本

20

 

試劑一

700

800

試劑二

200

200

混勻,30℃ 準(zhǔn)確水浴  30min

試劑三

40

40

 

混勻,靜置10min后,290nm處記錄測定管吸光值A(chǔ)1和對照管吸光值A(chǔ)2,△A=A1-A2。

注意:對照管只要做一管

PAL活性計算

(1)按蛋白濃度計算

單位定義:每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每min使290nm下吸光值變化0.1為一個酶

活性單位。

PAL(U/mg prot)=ΔA×V反總÷(Cpr×V樣)÷0.1÷T =17.3×ΔA÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

單位定義:每g組織每mL反應(yīng)體系中每min使290nm下吸光值變化0.1為一個酶活性單位。

PAL(U/g鮮重)=ΔA×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷0.1÷T =17.3×ΔA÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,1.04mL;V樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液

體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;

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