免疫熒光細胞化學染色方法

免疫熒光細胞化學染色方法 一、標本制作 可制作涂片、印片、細胞單層培養(yǎng)物、組織切片，經(jīng)適當固定或不固定，作免疫熒光染色用。 二、熒光抗體染色方法 （一）直接法 1．染色 切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光 抗體或兔抗人 IgG 或 IgA 熒光抗體等），在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止 干燥。 2．洗片 傾去存留的熒光抗體，將切片浸入 pH7.4或 pH7.2PBS 中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸 餾水洗1min，除去鹽結(jié)晶。 3．用50%緩沖（0.5mol/L 碳酸鹽緩沖液 pH9.0～9.5）甘油封固、鏡檢 4．對照染色 ①正常免熒光血清染色，如上法處理切片，結(jié)果應為陰性。②染色抑制試驗（一步法）：將熒光抗體和 未標記的抗體球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法處理切片。結(jié)果應為陰性。為證明此種染色抑制不 是由于熒光抗體被稀釋所致，可用鹽水代替未標記抗血清，染色結(jié)果應為陽性。此法結(jié)果較二步法穩(wěn)定。 ③類屬抗原染色試驗，前面已作敘述。 直接法比較簡單，適合做細菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和研 究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應的抗原，特異性高而敏感性較低。 （二）間接法 （1）切片固定后用毛細滴管吸取經(jīng)適當稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度， 37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS 洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。 （2）再滴加間接熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等），同上步驟，染色30min，37℃，緩沖鹽 水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。 對照染色：①抗體對照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進行染色，結(jié)果應為陰性。 ②抗原對照：即類屬抗原染色，亦應為陰性。③陽性對照。 間接法中上述方法稱雙層法（Double Layer Method）。另一種稱夾心法，即用未標記的特異性抗原加 在切片上先與組織中之相應抗體結(jié)合，再用該抗原之熒光抗體重疊結(jié)合其上，而間接地顯示出組織和細胞 中抗體的存在，方法步驟如下： ①切片或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi)。 ②滴加未標記的特異性抗原作用切片于37℃，30min。 ③緩沖鹽水洗2次，每次5min，吹干。 ④滴加特異性熒光抗體再用切片于37℃，30min。 ⑤如③水洗。 ⑥緩沖甘油封固，鏡檢。 間接法只需制備一種熒光抗體可以檢出多種抗原，敏感性較高，操作方法較易掌握，而且能解決一些 不易制備動物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查，所以已被廣泛應用于自身抗體和感染病人血 清的試驗。 （三）補體法 1．材料 （1）免疫血清60℃滅活20min，用 Kolmers 鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4，1：8……。補體用1：10 稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補體熒光抗體等，按下述的補體法染色。免疫血清補體結(jié)合的效價，如為1：32 則免疫血清應作1：8稀釋。 （2）補體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補體結(jié)合反應試管法所測定的結(jié)果，按2單位的比例， 用 Kolmers 鹽水稀釋備用。Kolmers 鹽水配法：即在 pH7.4、0.1mol/L 的磷酸緩沖鹽水中，溶解 MgSO4的 含量為0.01%濃度。 （3）抗補體熒光抗體：在免疫血清效價為1：4，補體為2單位的條件下，用補體染色法測定免疫豚鼠 球蛋白熒光抗體的染色效價，然后按染色效價1：4的濃度用 Kolmers 鹽水稀釋備用。 2．方法步驟 （1）涂片或切片固定。 （2）吸取經(jīng)適當稀釋之免疫血清及補體之等量混合液（此時免疫血清及補體又都稀釋一倍）滴于切片 上，37℃作用30min，置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。 （3）用緩沖鹽水洗2次，攪拌，每次5min，吸干標本周圍水液。 （4）滴加經(jīng)過適當稀釋之抗補體熒光抗體30min，37℃，水洗同（3）。 （5）蒸餾水洗1min，緩沖甘油封固。 3．對照染色 （1）抗原對照。 （2）抗血清對照：用正常兔血清代替免疫血清。 （3）滅活補體對照：將補體經(jīng)56℃30min 處理后，按補體同樣比例稀釋，與免疫血清等量混合后，進 行補體法染色。 本法之熒光抗體不受免疫血清的動物種屬的限制，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應用，敏感性亦較 間接法高，效價低的免疫血清亦可應用，節(jié) 省免疫血清，尤其是對檢查形態(tài)小的如立克氏體、病毒顆粒 等或濃度較低的抗原物質(zhì)時甚為理想。 （四）膜抗原熒光抗體染色法 本法應用直接法或間接法的原理和步驟，可對活細胞在試管內(nèi)進行染色，常用于 T 和 B 細胞、細胞培 養(yǎng)物、瘤細胞抗原和受體等的檢查和研究，陽性熒光主要在細胞膜上。FACS 即采用此法原理。 （五）雙重染色法 在同一標本上有兩個抗原需要同時顯示（如 A 抗原和 B 抗原），A 抗原的抗體用 FITC 標記，B 抗原的 抗體用羅達明標記，可采用以下染色方法： 1．一步法雙染色 先將兩種標記抗體按適當比例混合（A+B），按直接法進行染色。 2．二步法雙染色 先用 RB200標記的 B 抗體染色，不必洗去，再用 FITC 標記的 A 抗體染色，按間接法 進行。 結(jié)果：A 抗原陽性熒光呈現(xiàn)綠色，B 抗原陽性呈現(xiàn)桔紅色熒光。 （六）熒光抗體再染色法 若切片或其他標本經(jīng)某種熒光抗體染色后，未獲得陽性結(jié)果，而又疑有另外的病原體存在時，可用相 應的熒光抗體再染色。 有時存檔蠟塊不能再用以切片，也可用存檔的 HE 染色標本，褪去蓋片和顏色，再作免疫熒光或其它免疫細 胞化學的染色。 三、熒光抗原染色法 某些抗原可以用熒光素標記，制成熒光抗原，標記熒光素的方法與制備熒光抗體方法相同。用熒光抗 原可以直接檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗體，特異性較好，敏感性較差。染色方法同熒光抗體染色的直接法。 由于多數(shù)抗原難以提純或量少不昂貴，一般很少采用此法。