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細(xì)胞凍存與復(fù)蘇及細(xì)胞計(jì)數(shù)存活測(cè)試的操作方法與步驟

時(shí)間:2017/6/6閱讀:1428
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細(xì)胞凍存與復(fù)蘇及細(xì)胞計(jì)數(shù)存活測(cè)試的操作方法與步驟

細(xì)胞冷凍與復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)工作,可以解決細(xì)胞因?yàn)檫B續(xù)繼代造成的退變或轉(zhuǎn)化。細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)以及細(xì)胞凍存和復(fù)蘇后都需要細(xì)胞計(jì)數(shù)。
一、細(xì)胞冷凍保存
1、材料:
生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO (Sigma D-2650)、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片、等速降溫機(jī)(KRYO10SeriesII)
2、冷凍保存方法:
(1)傳統(tǒng)方法: 冷存管置于4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-80℃16~18小時(shí)(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長期儲(chǔ)存。
-20℃不可超過1小時(shí),以防止胞內(nèi)冰晶過大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降溫:利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase長期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。
3、步驟:
(1)冷凍前24-48小時(shí)更換半量或全量培養(yǎng)基,使細(xì)胞處于指數(shù)生長期。
(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制):另取一離心管,加入培養(yǎng)基、血清,逐滴加入二甲基亞砜 (DMSO)至20%濃度,即制成雙倍的凍存液,置于室溫下待用。
(3)離心收集培養(yǎng)之細(xì)胞,用加血清的培養(yǎng)基重懸起細(xì)胞,取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
(4)取與細(xì)胞懸液等量的凍存液,緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液,并晃動(dòng)試管,制成細(xì)胞凍存懸液(DMSOzui后濃度為5~10%),使細(xì)胞濃度為1~5×106cells/ml,混合均勻,分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中,1~2ml/vial,并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。嚴(yán)密封口后,注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期。然后進(jìn)行凍存。
4、注意事項(xiàng):
(1)欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài),約為80~90%致密度。冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì),例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。
(2)細(xì)胞在液氮中可長期凍存無*,而不會(huì)影響細(xì)胞活力;在-70度可保存數(shù)月。
(3)注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),無菌且無色(以0.22micron FGLP flon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品,如Sigma D-2650),以5~10ml小體積分裝,4℃避光保存,勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用,因長期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液,可避免DMSO直接加入時(shí)釋放的熱量對(duì)細(xì)胞的損傷。緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液是使細(xì)胞逐步適應(yīng)高滲,可降低細(xì)胞受損。DMSO可能引起部分白血病細(xì)胞株的分化,可換用10%甘油凍存。
(4)冷凍保存之細(xì)胞濃度:
①normal human fibroblast:1~3×106cells/ml
②hybridoma:1~3×106cells/ml,細(xì)胞濃度不要太高,某些hybridoma會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后。
③adherent tumor lines:5~7×106,依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度,而HeLa只需1~3×106cells/ml
④other suspensions:5~10×106cells/ml,human lymphocyte須至少5×106cells/ml。
(5)冷凍保護(hù)劑濃度為5或10%DMSO,若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時(shí),亦應(yīng)作一個(gè)backup culture,以防止冷凍失敗。
(6)凍存可用10%~90%的血清,一般高濃度血清有助于維護(hù)細(xì)胞活力,此處介紹20%終濃度有利于細(xì)胞懸浮而少沉積(4度時(shí)),復(fù)蘇存活率在80%~90%以上,對(duì)原代培養(yǎng)細(xì)胞,以90%血清凍存更為有效。
二、冷凍細(xì)胞活化
1、冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍,以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害,導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。
2、細(xì)胞活化后,約需數(shù)日,或繼代一至二代,其細(xì)胞生長或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。
3、材料
37℃恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基、無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶、液氮或干冰容器
4、步驟:
(1)操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套,防止冷凍管可能爆裂之傷害。
(2)自液氮或干冰容器中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,由于熱脹冷縮過程,此時(shí)蓋子易松掉。
(3)將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫,回溫后噴以70%酒精并擦拭之,移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。
(4)取出冷凍管,立即放入37℃水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。
(5)取出解凍之細(xì)胞懸浮液,緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:10~1:15),混合均勻,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1ml解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試。
(6)解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO或glycerol),依細(xì)胞種類而異,一般而言,大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除,則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi),離心1000rpm,5分鐘,移去上清液,加入新鮮培養(yǎng)基,混合均勻,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
(7)若不需立即去除冷凍保存劑,則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。
三、細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試
1、原理:
(1)計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。
(2)血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers,每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形,其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格,深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后,每個(gè)大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時(shí),計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目,乘以稀釋倍數(shù),再乘以104,即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。
(3)存活測(cè)試之步驟為dyeexclusion,利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色,而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整,染料無法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue染料,如果細(xì)胞不易吸收trypan blue,則用紅色之Erythrosin bluish。計(jì)算細(xì)胞活率:活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺(tái)盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成,隨時(shí)間延長,部分活細(xì)胞也開始攝取染料;因?yàn)榕_(tái)盼蘭對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的親和力,用不含血清的稀釋液,可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。
2、材料:
0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球計(jì)數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip);計(jì)數(shù)器(counter);低倍倒立顯微鏡;粒子計(jì)數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白細(xì)胞稀釋液(4%乙酸溶液)。
3、步驟:
(1)取50μl細(xì)胞懸浮液與50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。
(2)取少許混合液(約15μl)自血球計(jì)數(shù)盤chamber上方凹槽加入,蓋上蓋玻片,于100倍倒立顯微鏡下觀察,活細(xì)胞不染色,死細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色-Erythrosin bluish)。
(3)計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù),再除4,乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2,因與trypanblue等體積混合),zui后乘以104,即為每ml中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上,只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞)。
注:4大格細(xì)胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4=細(xì)胞數(shù)/ml;每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí),zui適濃度為5~10×105細(xì)胞/ml,此范圍外計(jì)數(shù)誤差偏大。高濃度細(xì)胞懸液,可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計(jì)數(shù)。
5、范例:
T75 monolayer culture制成10ml細(xì)胞懸浮液,取0.1ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻于試管中,取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤,計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目。
活細(xì)胞數(shù)/方格:55,62,49,59;死細(xì)胞數(shù)/方格:5,3,4,6;細(xì)胞總數(shù)=243
平均細(xì)胞數(shù)/方格=60.75;稀釋倍數(shù)=2;
細(xì)胞數(shù)/ml:60.75×104×2(稀釋倍數(shù))=1.22×106;
細(xì)胞數(shù)/flask(10ml):1.22×106×10ml=12.2×106
存活率:225/243﹦92.6%
在細(xì)胞復(fù)蘇過程中經(jīng)歷多次復(fù)蘇失敗,zui終在查閱了相關(guān)技術(shù)積累了足夠的復(fù)蘇技能后復(fù)蘇成功,上述是個(gè)人總結(jié)的細(xì)胞凍存復(fù)蘇及細(xì)胞計(jì)數(shù)的操作程序和注意事項(xiàng),望能為各位同學(xué)提供些參考。

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