培養(yǎng)小鼠樹突狀細胞攻略

1. C57Bl/6小鼠
2. 處死小鼠，75%酒精浸泡10min
3.解剖取出小鼠股骨和脛骨
4.去除骨上組織
5.沖洗骨髓腔，直至骨變白
6.收集的細胞沉淀以10000/ml細胞數(shù)接種，培養(yǎng)液含200U/mlrmGM-CSF和IL-4
答：
不知道U和ng之間是如何換算的呢，因為我用的是R&D的細胞因子，是以ng為單位的，是否像論壇上有戰(zhàn)友所說的1U＝1ng呢？

答：活性單位是個效應單位，是表示生物制品的活性的，和質量單位不是簡單換算關系。
有生物活性的物質，往往可殺死生物（如抗生素可殺死細菌）或促進生物增殖作用（多數(shù)細胞因子可促進細胞增殖）。在活性檢測時，設定一個濃度剃度，測得zui小致死量（如：抗生素）或zui大有效量也稱飽和有效量（如：某些細胞因子）的濃度，然后取中位數(shù)（即半數(shù)致死量或半數(shù)有效量）的倒數(shù)就是活性單位。如：R&D的說明書注明GM-CSF的Activity（活性）：ED50 =10 - 60 pg/mL(ED50，ED是zui大有效量，50表示50％，ED50就是半數(shù)zui大有效量）。你取其倒數(shù)，就可算出它的活性單位了，因此，它活性遠超1U/ng。
生物制品的活性不是固定不變的，不同的公司、不同的批次，其活性都不同，其中R&D的細胞因子活性是比較好的，也是比較穩(wěn)定的。
有幾點有點改變:
1 骨髓洗出來后,可以用200目的濾膜濾一次,有些操作中的渣子,碎片會被濾掉
2 樓主好像沒有測過(還是我沒看到)在細胞因子刺激的細胞總共中有多少表達CD11c,樓主是否用磁珠之類的東西富集過?我原來測過,小鼠骨髓來源細胞經細胞因子GM-CSF及IL-4作用二天后,CD11C表達大約20-40%之間.并不是所有的細胞都是DC.另外,淋巴細胞不加IL-2只有IL-4也可以存活三到四天,只是狀態(tài)比較差.
3 關于DC的形狀:其實DC基本沒有固定的形狀,我見過有梭形的,三角形的,四角形,有些形狀都不好說什么形,各種各樣的都有.不過很少有純圓形的,特別是貼壁后.
4 關于細胞因子用量:各個實驗室有不同的搞法,我們的用量是參考國內做DCzui牛的實驗室的用量(NAT IMMUNOLOGY):10ng/ml mGM-CSF和1ng/ml IL-4.效果很好.
5 關于TNF-a刺激成熟:zui常用的是TNF-a或LPS,原理有所區(qū)別:TNF是通過刺激DC表面的TNFR誘導細胞成熟,LPS則是通過刺激DC表面的TLR2,TLR4誘導DC成熟.成熟標志:CD80,CD86
6 關于抗原提呈:成熟DC也有抗原吞噬能力,只不過比未成熟DC弱.而未成熟DC亦有抗原提呈能力,只不過比成熟DC差.只是功能有偏向,并不是*沒有.
流式的本質是檢測細胞的分群。表現(xiàn)在流式的直方圖（如下圖）就是一個個“峰”，流式的直方圖就是分析這些“峰”，而是不是抽象地、孤立地見百分比。其實百分比是是一個很不清楚的概念。我們用流式檢測DC和DC的成熟程度，必須同時從兩方面來看，即峰的形態(tài)和峰的位置，而不是百分比，講百分比必須是某一細胞群占總體的百分比。任何時候離開細胞群（即圖上的“峰”）的概念談百分比，都是毫無意義的，沒有一點價值。
借用丁香園某網(wǎng)友（具體哪位網(wǎng)友記不清了，不好意思）的流式圖談談我對流式的理解。流式直方圖中，橫坐標表示熒光強度，即結合窄細胞上熒光抗體的多寡，也即細胞表達的抗原的多寡；縱坐標表示細胞數(shù)量。從圖中可以看出，峰底比較窄，約為兩個數(shù)量級（如：左圖101～103，右圖102.5~104.5），說明大多數(shù)細胞表達的表面分子數(shù)量比較一致，如左圖中94.7%的細胞的熒光強度在101～102.8，另外，只有5.3％的細胞（少數(shù)細胞）熒光強度比較高，在102.8～103.1，峰頂在102.2左右，表明熒光強度為102.2的細胞數(shù)zui多，因為該峰有點類似正態(tài)分布，因此，102.2近似于中位數(shù)和平均數(shù)，即平均熒光強度為102.2;右圖94.7%的細胞的熒光強度在102.8~104.5，5.3％的細胞（少數(shù)細胞）熒光強度比較低，在102.8以下，熒光強度為103.5的細胞數(shù)zui多。也就是說：與右圖相比，左圖（不成熟DC）的細胞總數(shù)中大多數(shù)細胞（94.7%）熒光強度比右圖（成熟DC）低，即：右圖中絕大多數(shù)細胞高表達CD11c（圖A）和CD86（圖B）。這就是不成熟DC和成熟DC的區(qū)別：這個窄而高的“峰”右移了，即大多數(shù)細胞的熒光強度提高了。
如果你不管流式的圖形（即細胞的分群，即峰的形態(tài)和位置）情況，光講百分比，那么左圖和右圖就沒有差別了，都是94.7%，有何意義？
另外，講百分比，一定要講某一區(qū)域的細胞占總數(shù)的百分比。如上圖，熒光強度為101～102.8的細胞占總數(shù)的百分比，如果取熒光強度為101～103.1d的細胞，那么就是100％。如圖C，如果取熒光強度為101～103.1（如圖C示）約70％，這群細胞比較一致，和103.1~105的細胞是有區(qū)別的；但如果熒光強度取101～104.5那就達到90％了；該圖中就全體細胞來說分布比較分散，從101～105都有，有低表達，有高表達，從峰的形態(tài)看可分為高表達和低表達的兩群。因此，離開峰的形態(tài)和位置談百分比，可以說是毫無意義的。