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上海信裕生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第12年

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培養(yǎng)小鼠樹突狀細(xì)胞攻略

時(shí)間:2017/6/22閱讀:1892
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培養(yǎng)小鼠樹突狀細(xì)胞攻略

1. C57Bl/6小鼠
2. 處死小鼠,75%酒精浸泡10min
3.解剖取出小鼠股骨和脛骨
4.去除骨上組織
5.沖洗骨髓腔,直至骨變白
6.收集的細(xì)胞沉淀以10000/ml細(xì)胞數(shù)接種,培養(yǎng)液含200U/mlrmGM-CSF和IL-4
答:
不知道U和ng之間是如何換算的呢,因?yàn)槲矣玫氖荝&D的細(xì)胞因子,是以ng為單位的,是否像論壇上有戰(zhàn)友所說的1U=1ng呢?

答:活性單位是個(gè)效應(yīng)單位,是表示生物制品的活性的,和質(zhì)量單位不是簡單換算關(guān)系。
有生物活性的物質(zhì),往往可殺死生物(如抗生素可殺死細(xì)菌)或促進(jìn)生物增殖作用(多數(shù)細(xì)胞因子可促進(jìn)細(xì)胞增殖)。在活性檢測時(shí),設(shè)定一個(gè)濃度剃度,測得zui小致死量(如:抗生素)或zui大有效量也稱飽和有效量(如:某些細(xì)胞因子)的濃度,然后取中位數(shù)(即半數(shù)致死量或半數(shù)有效量)的倒數(shù)就是活性單位。如:R&D的說明書注明GM-CSF的Activity(活性):ED50 =10 - 60 pg/mL(ED50,ED是zui大有效量,50表示50%,ED50就是半數(shù)zui大有效量)。你取其倒數(shù),就可算出它的活性單位了,因此,它活性遠(yuǎn)超1U/ng。
生物制品的活性不是固定不變的,不同的公司、不同的批次,其活性都不同,其中R&D的細(xì)胞因子活性是比較好的,也是比較穩(wěn)定的。
有幾點(diǎn)有點(diǎn)改變:
1 骨髓洗出來后,可以用200目的濾膜濾一次,有些操作中的渣子,碎片會(huì)被濾掉
2 樓主好像沒有測過(還是我沒看到)在細(xì)胞因子刺激的細(xì)胞總共中有多少表達(dá)CD11c,樓主是否用磁珠之類的東西富集過?我原來測過,小鼠骨髓來源細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子GM-CSF及IL-4作用二天后,CD11C表達(dá)大約20-40%之間.并不是所有的細(xì)胞都是DC.另外,淋巴細(xì)胞不加IL-2只有IL-4也可以存活三到四天,只是狀態(tài)比較差.
3 關(guān)于DC的形狀:其實(shí)DC基本沒有固定的形狀,我見過有梭形的,三角形的,四角形,有些形狀都不好說什么形,各種各樣的都有.不過很少有純圓形的,特別是貼壁后.
4 關(guān)于細(xì)胞因子用量:各個(gè)實(shí)驗(yàn)室有不同的搞法,我們的用量是參考國內(nèi)做DCzui牛的實(shí)驗(yàn)室的用量(NAT IMMUNOLOGY):10ng/ml mGM-CSF和1ng/ml IL-4.效果很好.
5 關(guān)于TNF-a刺激成熟:zui常用的是TNF-a或LPS,原理有所區(qū)別:TNF是通過刺激DC表面的TNFR誘導(dǎo)細(xì)胞成熟,LPS則是通過刺激DC表面的TLR2,TLR4誘導(dǎo)DC成熟.成熟標(biāo)志:CD80,CD86
6 關(guān)于抗原提呈:成熟DC也有抗原吞噬能力,只不過比未成熟DC弱.而未成熟DC亦有抗原提呈能力,只不過比成熟DC差.只是功能有偏向,并不是*沒有.
流式的本質(zhì)是檢測細(xì)胞的分群。表現(xiàn)在流式的直方圖(如下圖)就是一個(gè)個(gè)“峰”,流式的直方圖就是分析這些“峰”,而是不是抽象地、孤立地見百分比。其實(shí)百分比是是一個(gè)很不清楚的概念。我們用流式檢測DC和DC的成熟程度,必須同時(shí)從兩方面來看,即峰的形態(tài)和峰的位置,而不是百分比,講百分比必須是某一細(xì)胞群占總體的百分比。任何時(shí)候離開細(xì)胞群(即圖上的“峰”)的概念談百分比,都是毫無意義的,沒有一點(diǎn)價(jià)值。
借用丁香園某網(wǎng)友(具體哪位網(wǎng)友記不清了,不好意思)的流式圖談?wù)勎覍?duì)流式的理解。流式直方圖中,橫坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度,即結(jié)合窄細(xì)胞上熒光抗體的多寡,也即細(xì)胞表達(dá)的抗原的多寡;縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)量。從圖中可以看出,峰底比較窄,約為兩個(gè)數(shù)量級(jí)(如:左圖101~103,右圖102.5~104.5),說明大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)的表面分子數(shù)量比較一致,如左圖中94.7%的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度在101~102.8,另外,只有5.3%的細(xì)胞(少數(shù)細(xì)胞)熒光強(qiáng)度比較高,在102.8~103.1,峰頂在102.2左右,表明熒光強(qiáng)度為102.2的細(xì)胞數(shù)zui多,因?yàn)樵摲逵悬c(diǎn)類似正態(tài)分布,因此,102.2近似于中位數(shù)和平均數(shù),即平均熒光強(qiáng)度為102.2;右圖94.7%的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度在102.8~104.5,5.3%的細(xì)胞(少數(shù)細(xì)胞)熒光強(qiáng)度比較低,在102.8以下,熒光強(qiáng)度為103.5的細(xì)胞數(shù)zui多。也就是說:與右圖相比,左圖(不成熟DC)的細(xì)胞總數(shù)中大多數(shù)細(xì)胞(94.7%)熒光強(qiáng)度比右圖(成熟DC)低,即:右圖中絕大多數(shù)細(xì)胞高表達(dá)CD11c(圖A)和CD86(圖B)。這就是不成熟DC和成熟DC的區(qū)別:這個(gè)窄而高的“峰”右移了,即大多數(shù)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度提高了。
如果你不管流式的圖形(即細(xì)胞的分群,即峰的形態(tài)和位置)情況,光講百分比,那么左圖和右圖就沒有差別了,都是94.7%,有何意義?
另外,講百分比,一定要講某一區(qū)域的細(xì)胞占總數(shù)的百分比。如上圖,熒光強(qiáng)度為101~102.8的細(xì)胞占總數(shù)的百分比,如果取熒光強(qiáng)度為101~103.1d的細(xì)胞,那么就是100%。如圖C,如果取熒光強(qiáng)度為101~103.1(如圖C示)約70%,這群細(xì)胞比較一致,和103.1~105的細(xì)胞是有區(qū)別的;但如果熒光強(qiáng)度取101~104.5那就達(dá)到90%了;該圖中就全體細(xì)胞來說分布比較分散,從101~105都有,有低表達(dá),有高表達(dá),從峰的形態(tài)看可分為高表達(dá)和低表達(dá)的兩群。因此,離開峰的形態(tài)和位置談百分比,可以說是毫無意義的。

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